1. Башлангыч аңлау

Бу этапта без кайбер төшенчәләрне һәм терминологияне аңларга тиеш, шулай итеп олылар алдында хаталар ясамас өчен:

С: RT-PCR, qPCR, Real-time PCR һәм реаль вакыттагы RT-PCR арасында нинди аерма бар?

Answerавап: RT-PCR кире транскрипция PCR(кире транскрипция PCR, RT-PCR), полимераз чылбыр реакциясенең киң кулланылган варианты (PCR).RT-PCRда, РНК полосасы кире тулы ДНКга транскрипцияләнә, аннары PCR тарафыннан ДНК көчәйтү шаблоны буларак кулланыла.
Реаль вакыт-PCR һәм qPCR(Санлы Rea-ltime-PCR) бер үк нәрсә, икесе дә реаль вакытта санлы PCR, димәк, PCR циклының реаль вакыттагы мәгълүмат язмалары бар, шуңа күрә башлангыч шаблоннар саны төгәл анализ белән көйләнергә мөмкин.

Реаль вакыт PCR (реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR) һәм Кире транскрипция PCR (кире транскрипция PCR) кыскартылган кебек тоелса да, халыкара конвенция: RT-PCR махсус кире транскрипциягә карый.PCR, Real-time PCR гадәттә qPCR дип кыскартыла (санлы реаль-вакыт PCR).

Realәм реаль вакыттагы RT-PCR (RT-qPCR), бу кире транскрипция PCR, флуоресцент санлы технология белән кушылган.: башта РНК кире транскрипциядән cDNA (RT) алыгыз, аннары санлы анализ өчен Real-time PCR кулланыгыз (qPCR).Күпчелек лабораторияләр RT-qPCR ясыйлар, ягъни РНК экспрессиясен көйләү, шуңа күрә лабораториядә сөйләшкән qPCR чынлыкта RT-qPCR турында бара, ләкин клиник кушымталарда әле күп ДНК тестлары барлыгын онытмагыз.Санлы анализ, мәсәлән, В гепатиты HBV вирусы.

Сорау: Флюоресцент санлы PCRны күп укыганнан соң, ни өчен көчәйтелгән фрагмент 80-300bp диапазонында контрольдә тотылырга тиеш?

.Авап: Genәр ген эзлеклелегенең озынлыгы төрле, кайберләре берничә кб, кайберләре йөзләрчә ат көченә, ләкин праймериз ясаганда продуктның озынлыгы 80-300bp булырга тиеш, бик кыска яки бик озын флуоресцент санлы PCR ачыклау өчен яраксыз.Продукциянең фрагменты бик кыска, праймер-димердан аерып булмый.Праймер-димерның озынлыгы 30-40bp тирәсе, һәм аның праймер-димер яки 80bp-тан кимрәк булуын аеру кыен.Әгәр продукт фрагменты бик озын булса, 300bp-тан артса, ул җиңел көчәйтү эффективлыгына китерәчәк һәм ген күләмен эффектив таба алмый.

Мәсәлән, син сыйныфта ничә кеше булганын санасаң, ничә авыз барлыгын санарга кирәк.Геннарны ачыклаганда шулай ук, сез генның билгеле эзлеклелеген ачыкларга тиеш, бөтен эзлеклелек.Кешеләрне санарга теләсәгез, авызны да, борынны да, колакны да, стаканны да санарга кирәк, һәм хаталар ясау җиңел.

Зурайту өчен, биологик тикшеренүләрдә ноктадан-өлкәгә кадәр бик күп тикшеренү очраклары бар, чөнки теләсә нинди төрнең ген эзлеклелеге бик озын, кирәк булмаган һәм барлык фрагментларны үлчәү кирәк түгел, мәсәлән, 16S бактерия эзлеклелеге, бу бактерияләрнең консерватив эзлеклелеген тикшерү, билгеле бер бактерия санын санау.

С: qPCR праймериз дизайны өчен оптималь озынлык нинди?

.Авап: Гомумән алганда, праймерның озынлыгы якынча 20-24bp, бу яхшырак.Әлбәттә, без праймерны эшләгәндә праймерның ТМ кыйммәтенә игътибар итергә тиеш, чөнки бу оптималь анналь температура белән бәйле.Күп экспериментлардан соң, 60 ° C яхшырак ТМ кыйммәте икәнлеге исбатланды.Әгәр дә аннальинг температурасы бик түбән булса, ул җиңел булмаган спецификациягә китерәчәк.Әгәр анналь температурасы артык югары булса, көчәйтү эффективлыгы чагыштырмача түбән булачак, көчәйтү кәкресенең иң югары ноктасы соңрак башланачак, һәм КТ бәясе тоткарланачак.

С: Буяу ысулы тикшерү ысулыннан ничек аерылып тора?

Answerавап: Буяу ысулыКайбер флуоресцент буяулар, мәсәлән SYBR Green P, PicoGreen, BEBO һ.б., үзләре яктылык җибәрмиләр, ләкин ике катлы ДНКның кечкенә трубкасына бәйләнгәннән соң флуоресцент чыгаралар.Шуңа күрә, PCR реакциясе башында, машина флуоресцент сигналны таба алмый.Реакция аннальинг-киңәйтү этабына җиткәч, ике юл ачыла, һәм яңа полоса ДНК полимерасы тәэсирендә синтезлана, һәм флуоресцент молекула dsDNA кечкенә трюкка бәйләнә.PCR цикллары саны арта барган саен, буяулар ике катлы ДНК белән берләштерелә, һәм флуоресцент сигнал да өзлексез көчәйтелә.Буяу ысулы нигездә фәнни тикшеренүләрдә кулланыла.
PS: Эксперимент ясаганда сак булыгыз, буяу кеше ДНКсы белән кушылырга тиеш, аны флуоресцент кешегә әйләндерү өчен сак булыгыз.

Буяу ысулы (сулда) тикшерү ысулы (уңда)
PS: Эксперимент ясаганда сак булыгыз, буяу кеше ДНКсы белән кушылырга тиеш, аны флуоресцент кешегә әйләндерү өчен сак булыгыз.

SYBR Green DNA ДНКның кечкенә трюкына бәйләнә

Тикшерү ысулыТакман зонасы - иң еш кулланыла торган гидролиз зонасы.Зондның 5 ′ очында флюоресцент төркем бар, гадәттә FAM, һәм зонд үзе максатлы генга тулыландыручы эзлеклелек.3 ′ ахырында флюоресцент сүндерү төркеме бар.Флуоресцент резонанс энергия тапшыру принцибы буенча (Фөрстер резонансы энергия тапшыру, ФРЕТ), репортер флуоресцент төркеме (донор флуоресцент молекуласы) һәм сүндерүче флуоресцент группасы (аксессуар флуоресцент молекуласы) дулкынлангач, спектрлар бер-берсе белән капланган һәм ераклык бик якын булганда (7-10нм), донор молекуласының дулкынлануы флюоресенцияне кабул итә.Шуңа күрә, PCR реакциясе башында, тикшерү бушлай һәм системада булмаганда, хәбәрче флуоресцент төркеме флуоресцент чыгармый.Аннальләштергәндә, праймер һәм зонд шаблонга бәйләнә.Озайту этабында полимераз яңа чылбырларны өзлексез синтезлый.ДНК полимеразының 5′-3 ′ экзонуклаз активлыгы бар.Зондка җиткәч, ДНК полимеразы шаблоннан гидролизлаштырачак, хәбәрче флуоресцент төркемен сүндергеч флюоресцент төркеменнән аерачак һәм флуоресцент сигналны чыгарачак.Проб белән шаблон арасында бер-берең белән бәйләнеш булганлыктан, тикшерү ысулы тестның төгәллеге һәм сизгерлеге ягыннан буяу ысулыннан өстенрәк.Тикшерү ысулы нигездә диагностикада кулланыла.

С: Абсолют санлаштыру нәрсә ул?Нисби санлаштыру нәрсә ул?

.Авап: Абсолют санлаштыру qPCR белән тикшерелергә тиешле үрнәкнең башлангыч күчермә санын исәпләүгә карый, мәсәлән, 1мл канда ничә HBV вирусы бар.Нисби санлаштыру белән алынган нәтиҗә - билгеле бер үрнәктә максатлы ген күләменең үзгәрүе, башка белешмә үрнәгенә караганда, һәм ген экспрессиясе көйләнгән яки түбән көйләнгән.

С: РНК чыгару күләме, кире транскрипция эффективлыгы һәм көчәйтү эффективлыгы эксперимент нәтиҗәләренә йогынты ясармы?
С: Саклау, чыгару реагентлары, кире транскрипция реагентлары һәм яктылык җибәрүче куллану материаллары эксперимент нәтиҗәләренә йогынты ясармы?
С: Эксперименталь мәгълүматны нинди ысул төзәтә ала?

Бу сорауларга килгәндә, без аларны түбәндәге алдынгы һәм алдынгы бүлекләрдә җентекләп тасвирлыйбыз.
2. Алдынгы белем

Реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCRга килгәндә, без чынбарлыкны танырга тиеш, ел саен меңләгән фәнни тикшеренүләр бастырыла, алар арасында флюоресцент санлы PCR технологиясе аз түгел.

Әгәр дә флюоресцент санлы PCR экспериментын үлчәү өчен уртак стандарт булмаса, нәтиҗәләр төрлечә булырга мөмкин.Бер үк төрдәге бер үк ген өчен, бер үк эшкәртү ысулы белән, ачыклау нәтиҗәләре дә төрлечә булачак, һәм соңгы кешеләргә шул ук нәтиҗәләрне кабатлау кыен булачак.Кайсы дөрес, кайсының начар икәнен сез беркем дә белми.

Бу флуоресцент санлы PCR - алдау технологиясе яки ышанычсыз технология дигәнне аңлатамы?Noк, чөнки флуоресцент санлы PCR сизгеррәк һәм төгәлрәк, һәм бераз ялгыш операция бөтенләй капма-каршы нәтиҗәләр китерәчәк.Кечкенә югалту мең чакрым ераклыкта.Мәкалә авторы рецензияләүчеләр тарафыннан берничә тапкыр җәфаланырга мөмкин.Шул ук вакытта журнал рецензияләүчеләренә дә төрле эксперимент нәтиҗәләрен сайлау кыен.

Гомумән алганда, PCR экспериментларында консенсус җитмәвен күрсәтә.Бу максаттан, тармактагы өлкән галимнәр стандартлар формалаштыра башладылар,катнашучылардан бу стандартларга туры килер өчен мәкаләдә кирәкле эксперименталь һәм мәгълүмат эшкәртү детальләрен (кирәкле мәгълүматны кертеп) бирүне таләп итү.

Тикшерүчеләр экспериментның сыйфатын бу детальләрне укып хөкем итә алалар;булачак укучылар моны экспериментны кабатлау яки экспериментны яхшырту өчен куллана ала.Аннары бу ысул белән алынган эксперименталь нәтиҗәләр мәгълүмат, югары сыйфатлы һәм куллану белән тулы.

MIBBI (Биологик һәм биомедицина тикшерүләре өчен минималь мәгълүмат -http: // www.mibbi.org) барлыкка килгән.MIBBI - экспериментлар өчен стандартлар бирүче проект.Ул табигатьтә бастырылган.Бу проект төрле биологик экспериментларга юнәлтелгән, шул исәптән күзәнәк биологиясе, Microarray, qPCR һ.б. без хәзер тикшерәчәкбез һ.б., һәм кулъязмалар җибәргәндә һәр эксперимент төрен тәэмин итә.Бу мәгълүмат һәрвакыт бирелергә тиеш.

MIBBI проектында флюоресцент санлы PCR белән бәйле ике мәкалә бар, алар:
· RDML (Real-Time PCR Мәгълүматны билгеләү теле) - реаль вакытта санлы PCR мәгълүматлары өчен структуралаштырылган тел һәм отчет кулланмасы.
· MIQE (Санлы реаль-вакыт PCR экспериментларын бастыру өчен минималь мәгълүмат) - реаль санлы PCR экспериментлары турында мәкаләләр бастыру өчен минималь мәгълүмат.
Башта, терминология спецификациясе турында RDML турында сөйләшик.

Әгәр дә бар нәрсә өчен стандарт билгеләмә булмаса, дискуссияне дәвам итү мөмкин түгел, шуңа күрә имтиханда терминнарны аңлату бик мөһим.
Флюоресцент санлы PCR экспериментында кулланылган терминология түбәндәге эчтәлекне үз эченә ала.QIAGEN безнең өчен иң яхшы кыскача мәгълүмат ясады.Түбәндәгеләр барысы да корытовар .

Көчләндерү сызыгы
Көчәйтү сызыгы PCR процессы вакытында ясалган сызыкны аңлата, цикл саны абсцисса һәм реаль вакытта флюоресенция интенсивлыгы ординат рәвешендә.

Искиткеч көчәйтү сызыгы түбәндәге үзенчәлекләргә ия булырга тиеш: нигез яссы яки бераз кимегән, һәм югары күтәрелеш тенденциясе юк;кәкре инфляция ноктасы ачык, һәм экспоненциаль этапның түбәсе көчәйтү эффективлыгына пропорциональ.Тау зуррак булса, көчәйтү эффективлыгы югары;гомуми көчәйтү сызыгы Параллелизм яхшы, һәр трубаның көчәйтү эффективлыгы охшаш;Аз концентрацияле үрнәкләрнең көчәйтү сызыгының экспоненциаль этабы ачык.

Базель (Базель)
Төп цикл - башлангыч циклның шау-шу дәрәҗәсе, гадәттә, 3-15 нче цикл арасында үлчәнәләр, чөнки көчәйтү продукты китергән флюоресенция кыйммәте арту бу чорда табылмый.Төп базаны исәпләү өчен кулланылган цикллар саны төрле булырга мөмкин, һәм шаблонның зур күләме кулланылса яки максатлы генның экспрессия дәрәҗәсе зур булса, аны киметергә кирәк булырга мөмкин.

Төп базаны кую сызыклы көчәйтү сызыгыннан флуоресцент мәгълүматны карарга тиеш.Күчерелеш сызыгы үсеше база циклының төп саныннан зуррак цикл саны белән башлана.Targetәрбер максат эзлеклелеге өчен нигезләр аерым куелырга тиеш.Беренче циклда ачыкланган уртача флуоресцент кыйммәтләр көчәйтелгән продуктларда алынган флуоресцент кыйммәтләрдән алынырга тиеш.Төрле Real-Time PCR программаларының соңгы версияләре аерым үрнәкләр өчен төп параметрларны автоматик оптимизацияләргә мөмкинлек бирә.

PCR көчәйтү реакциясенең беренче берничә циклында флуоресцент сигнал күп үзгәрми.Туры сызыкка якынлашу база дип атала, ләкин беренче берничә циклны игътибар белән карасак, астагы рәсемдә нәрсә булганын күрәбез.

Фон Фон
реакциядә специаль булмаган флуоресцент кыйммәт.Мәсәлән: эффектив булмаган флуоресцентны сүндерү;яки SYBR Green куллану аркасында күп санлы ДНК шаблоннары.Сигналның фон компонентлары математик яктан Real-Time PCR программа алгоритмы белән бетерелә.

Репортер сигналы
Репортер сигналы SYBR Green тарафыннан тудырылган флюоресцент сигналны яки Real-Time PCR вакытында флуоресцентлы эзлекле эзләнүләр.

Нормальләштерелгән хәбәрче сигналы (RN)
RN - һәр циклда үлчәнгән пассив белешмә буяуның флюоресенция интенсивлыгы белән бүленгән хәбәрче буяуның флюоресенция интенсивлыгын аңлата.

Пассив белешмә буяу
Кайбер Реаль Вакыт PCR-ларында,флюоресцент буяу ROX флюоресцент сигналны нормальләштерү өчен эчке сылтама буларак кулланыла.Дөрес булмаган пипетинг, кое торышы, кое нигезендә флюоресенция үзгәрүләре аркасында үзгәрүләр төзәтә.

Флуоресцент бусагасы (бусага)
фон кыйммәтеннән һәм көчәйтү сызыгы плато кыйммәтеннән түбәнрәк көйләнде.Бу PCR ачыклауның лог-сызыклы диапазонын күрсәтеп, көчәйтү сызыгының сызыклы төбәгендә булырга тиеш.PCR-ның лог-сызыклы фазасын җиңел танып белү өчен, бусага лог-көчәйтү сызыгы күренешендә куелырга тиеш.Real-Time PCRда берничә максатлы ген булса, бусага һәр максат өчен куелырга тиеш.Гадәттә, PCR реакциясенең беренче 15 циклының флуоресцент сигналы флуоресцент фон сигналы буларак кулланыла, һәм флюоресенция бусагасы PCRның беренче 3-15 циклының флуоресцент сигналының стандарт тайпылышыннан 10 тапкыр, һәм флюоресенция бусагасы PCR көчәйтүнең экспоненциаль этабында куелган.Гомумән алганда, һәр коралның флюоресенция бусагасы кулланылганчы куелган.

Cyикл бусагасы (КТ) яки кисешү ноктасы (СП)
Көчләндерү сызыгы бусагадан узган цикл (ягъни, флуоресцентны ачыклау ноктасы сизелерлек арта).КТ фракция булырга мөмкин һәм башлангыч шаблон күләмен исәпләргә мөмкин.КТ кыйммәте һәр PCR реакция трубасындагы флуоресцент сигнал билгеләнгән бусагага җиткәч кичерелгән цикллар санын күрсәтә.Eachәр шаблонның КТ бәясе белән шаблонның башлангыч күчермә номерының логарифмасы арасында сызыклы бәйләнеш бар ,.башлангыч күчермә саны югарырак, КТ бәясе кечерәк, һәм киресенчә.Стандарт сызык билгеле башлангыч күчермә номеры булган стандартны кулланып ясалырга мөмкин, анда абсцисса КТ кыйммәтен, ә ординат беренче күчермә номерының логарифмасын күрсәтә.Шуңа күрә, билгесез үрнәкнең КТ бәясе алынган очракта, үрнәкнең башлангыч күчермә саны стандарт сызыктан исәпләнә ала.

ΔКТ кыйммәте
ΔКТ бәясе тасвирлыймаксатлы ген белән туры килгән эндоген белешмә ген КТ бәясе арасындагы аерма, хуҗалык гены кебек, һәм кулланылган шаблон күләмен нормалаштыру өчен кулланыла:
⇒ΔCT = CT (максатлы ген) - КТ (эндоген белешмә ген)

ΔΔКТ кыйммәте
ΔΔCT кыйммәте кызыксыну үрнәгенең уртача ΔΔCT кыйммәте (мәсәлән, стимуллаштырылган күзәнәкләр) һәм белешмә үрнәгенең уртача ΔΔT кыйммәте (мәсәлән, стимулсыз күзәнәкләр) арасындагы аерманы тасвирлый.Белешмә үрнәге калибрлау үрнәге дип тә атала һәм бүтән барлык үрнәкләр дә чагыштырмача санлаштыру өчен нормальләштерелгән:
⇒ΔΔCT = уртача ΔCT (кызыксыну үрнәге) - уртача ΔCT (белешмә үрнәге)

Эндоген белешмә геннар (эндоген белешмә геннар)
Эндоген белешмә геннарның экспрессив дәрәҗәләре, мәсәлән, хуҗалык итү геннары (хуҗалык итү геннары), үрнәкләр арасында аерылмыйлар.Белешмә генның CT кыйммәтләрен максатлы ген белән чагыштыру, максатлы генның экспрессия дәрәҗәсен РНК яки cDNA кертү күләменә нормалаштырырга мөмкинлек бирә (өстә ΔCT кыйммәтләре бүлеген карагыз).

Эчке белешмә геннар өчен дөресмөмкин булган РНК деградациясе яки РНК үрнәкләрендә фермент ингибиторлары, шулай ук ​​РНК эчтәлегенең төрләнеше, кире транскрипция эффективлыгы, нуклеин кислотасын торгызу һәм үрнәк эшкәртү.Оптималь белешмә ген (ларны) сайлау өчен, без алгоритмны үзгәрттек, аның эксперименталь шартларга бәйле оптималь сылтаманы сайларга рөхсәт итәр өчен.

Эчке контроль
Максат эзлеклелеге белән бер үк реакциядә көчәйтелгән һәм башка зонд белән тикшерелгән контроль эзлеклелеге (ягъни, дуплекс PCR башкару).Эчке контроль еш уңышсыз көчәйтмәләрне кире кагу өчен кулланыла, мәсәлән, максат эзлеклелеге ачыкланмаганда.
Калибрлау үрнәге
Генның чагыштырма дәрәҗәсен билгеләү өчен бүтән үрнәкләрне чагыштыру өчен чагыштырма күләмдә кулланылган белешмә үрнәге (мәсәлән, күзәнәк сызыгыннан яки тукымалардан чистартылган РНК).Калибрлау үрнәге теләсә нинди үрнәк булырга мөмкин, ләкин гадәттә контроль (мәсәлән, эшкәртелмәгән үрнәк яки экспериментның нульдән алынган үрнәге).

Позитив контроль
белән контроль реакцияләрне кулланыгызбилгеле күләмдә шаблон.Позитив контрольләр еш кына праймер комплекты яки праймериз комплектының дөрес эшләвен һәм реакциянең дөрес куелганын тикшерү өчен кулланыла.

Шаблон контроле юк (NTC)
Гадәттә су белән алыштырыла торган шаблоннан кала көчәйтү реакциясенең барлык кирәкле компонентларын үз эченә алган контроль реакция.NTC куллану реагент пычрану яки чит ДНК аркасында булган пычрануны таба ала, шулай итеп ачыклау мәгълүматларының дөреслеген һәм ышанычлылыгын тәэмин итә.NTC контролен көчәйтү пычрануны күрсәтә.

ТР контроле юк (NRT)
РНК чыгару процессында калдыклы геном ДНК булырга мөмкин, ул бик зарарлы һәм мәгълүмат сыйфатына тәэсир итүче һәм qPCRның табигый дошманы, шуңа күрә экспериментлар эшләгәндә ул РНК ачыклауны көчәйтү өчен эшләнергә тиеш.Ике ысул бар, берсе - интроннар аша праймериз ясау, икенчесе - ДНКны тулысынча бетерү, кайсысы яхшырак, соңрак каралачак.NTR контроле - ДНК пычрануын ачыклау өчен тылсымлы көзге.Әгәр дә көчәйтү бар икән, димәк, пычрану бар.

Стандартлар
Стандартлар - билгеле концентрация үрнәкләре яки стандарт сызык төзү өчен кулланыла торган номер.Стандартның тотрыклылыгын тәэмин итү өчен, ген фрагменты гадәттә плазмидка клонлаштырыла һәм стандарт буларак кулланыла.

Стандарт сызык
гадәттә икеләтә катнашу буенча стандарт продукт белән ким дигәндә 5 концентрация градиентына эретелә, һәм КТ бәясе координаталарында 5 балл сызыла, һәм нокталар стандарт сызык ясау өчен сызык формалаштыру өчен тоташтырылган.Eachәрбер стандарт сызык өчен аның дөреслеген тикшерергә кирәк.Килеш бәясе –3.3 белән .83.8 арасында төшә, һәм һәр концентрация өчпочмакта башкарыла.Башка нокталардан шактый аерылып торган балларны ташларга кирәк.Сынап каралачак үрнәкнең КТ бәясе стандарт сызыкка китерелә, һәм сыналачак үрнәкнең экспрессия дәрәҗәсе исәпләнә ала.

Сынап карала торган үрнәкнең КТ бәясе стандарт сызыкка китерелә, һәм сыналачак үрнәкнең башлангыч күчермә саны исәпләнә ала.

Эффективлык һәм тау
Стандарт сызыкның түбәсе реаль вакыттагы PCR эффективлыгын күрсәтә.
· -3.322 түбәсе PCR көчәйтү эффективлыгы 1, яки 100% эффектив булуын күрсәтә, һәм PCR продуктының күләме һәр циклда икеләтә арта.
· .33.322-дән ким булган тау (мәсәлән, –3.8) PCR эффективлыгын күрсәтә
· .33.322-дән зуррак тау (мәсәлән, –3.0) PCR эффективлыгы 100% тан зуррак булып күренүен күрсәтә, кызык, PCRның бер циклы көчәйтелгән продуктны икеләтә арттыра аламы?Бу ситуация PCR реакциясенең сызыксыз фазасында була, ягъни специфик булмаган көчәйтүнең күп күләме бар.

эретү сызыгы
QPCR көчәйтү тәмамлангач, PCR продукты җылытыла.Температура күтәрелгәч, ике катлы көчәйтү продукты әкренләп эри, нәтиҗәдә флюоресенция интенсивлыгы кими.Билгеле температура (ТМ) җиткәч, күп санлы продуктлар эреп бетәчәк.Флуоресцент кискен төшә.Төрле PCR продуктлары төрле Tm кыйммәтләренә һәм эретү температурасына ия, шулай итеп PCR үзенчәлеген ачыкларга мөмкин.

Эретү сызыгы (тудыру сызыгы)
Эретү сызыгы иң югары картаны формалаштыру өчен алынган, ул PCR продукт фрагментларын интуитив рәвештә күрсәтә ала.Эретү температурасы ДНК фрагментының Tm кыйммәте булганлыктан, ДНК фрагментының Tm кыйммәтенә тәэсир итүче кайбер параметрлар хөкем ителергә мөмкин, мәсәлән, фрагмент зурлыгы, GC эчтәлеге һ.б. Гомумән алганда, безнең төп проектлау принциплары буенча,көчәйтелгән продуктның озынлыгы 80-300bp диапазонында, шуңа күрә эретү температурасы 80 ° C белән 90 ° C арасында булырга тиеш.

Эретү сызыгын аңлату: Әгәр бердәнбер төп биеклек 80 ° C-90 ° C арасында күренсә, бу флуоресцент санлы PCR камил дигән сүз;төп чокы 80 ° C-90 ° C арасында, ә төрле биеклекләр 80 ° C астыннан күренсә, праймер димеры нигездә карала.Сез аны чишү өчен аннальинг температурасын күтәрергә тырыша аласыз;төп чокы 80 ° C-90 ° C арасында күренсә, һәм температура күтәрелгәч төрле пик кабат күренсә, нигездә ДНК пычрануы бар дип санала, һәм экспериментның башлангыч этабында ДНКны чыгарырга кирәк.

Әлбәттә, аномаль ситуацияләр бар, алар түбәндә бер-бер артлы өзеләчәк.
3. Алдынгы белем

QPCR ясау өчен, мин MIQE әйтергә тиеш,Минималь мәгълүматбастыру өченСанРеаль Вакыт PCRЭкспериментлар - реаль вакыт санлы PCR турында мәкаләләр бастыру өчен минималь мәгълүматэкспериментлар.Everyoneәркемнең аңлавын гадиләштерү өчен, без төп эчтәлекне гадиләштерәчәкбез.

Сез MIQE-ның оригиналь текстын Интернетта эзли аласыз, һәм иң мөһиме - улмәкалә бастырганда бирелергә тиешле мәгълүмат исемлеге .

Тикшерүчеләр экспериментның сыйфатын бу детальләрне укып хөкем итә алалар;булачак укучылар моны экспериментны кабатлау яки яхшырту өчен куллана ала.
Әйтергә кирәк, бу исемлектә һәр исемлекнең мөһимлеге E яки D белән билгеләнә.Нинди мәгънәгә килә?Э: мөһим мәгълүмат (тапшырылырга тиеш);Г: кирәкле мәгълүмат (мөмкин кадәр күбрәк бирегез).

MIQE (1) - Эксперименталь дизайн
Аспирантураны тәмамлагач, оборонасын тәмамлаган күпчелек караклар экспериментны ничек ясарга, дәфтәрләрен ачарга һәм укытучы кушканны эшләргә белмиләр.Нәтиҗәдә, эксперименталь дизайн катгый булмады, һәм журнал редакциясе бу рәсемне һәм бу рәсемне ясарга теләгәннәрен әйттеләр, шуңа күрә алар гаҗәпләнделәр.Менә шулай итеп чүпрәкләр ясала!

Өйгә якынрак, экспериментның беренче принцибыэксперименталь логиканың катгыйлыгы.Иң төп нәрсә - эксперименталь дизайн, һәм эксперименталь дизайнның иң мөһиме - максатчан үрнәкне, белешмә үрнәген (контроль) һәм кабатлау санын ничек куярга, шулай итеп эксперименталь мәгълүматларга сылтама, чагыштырырлык һәм ышандырырлык.

Максатлы үрнәкбилгеле бер дәваланудан соң максатлы генны табуны таләп итә торган үрнәкне күрсәтә.Белешмә үрнәгебернинди дәвалаусыз үрнәк, ул биологиядә еш кыргый тип дип атала.

Эксперименталь кабатлаубик мөһим.Гадәттә, инандыргыч репликалар саны өчтән артык булырга тиеш.Биологик репликация нәрсә һәм техник репликация нәрсә икәнен аерырга кирәк.

Биологик репликалар: Төрле материаллар белән эшләнгән бер үк тикшерү эксперименты (вакыт, үсемлекләр, партияләр, реакция тәлинкәләре).

Биологик кабатлау
Мисал итеп борычны пестицид белән эшкәртүне алыйк.Без пестицидларны ABC-ның өч үсемлегенә сиптерергә телибез, аннары ABC-ның өч үсемлеге өч биологик реплика, һәм алар төрле материаллар белән үткәрелгән бер үк тикшерү эксперименты.Ләкин эксперимент буларак, контроль, һичшиксез, кирәк, шуңа күрә без А үсемлегенең эксперименталь төркемен формалаштыру өчен А заводының бер ботакларын сиптерә алабыз, һәм контроль төркем булдыру өчен А заводының бүтән ботакларын сиптермибез.В һәм С өчен дә шулай эшләгез.

Техник репликалар (Техник репликалар): Бу кабатланган эксперимент, операция аркасында килеп чыккан хаталардан саклану өчен эшләнгән, ул бер үк материалга кертелгән икеләтә тишек.Ике дәвалау да, контроль дә максатлы генның көйләнмәләрен (минималь өч) һәм эчке белешмә ген булырга тиеш.

Техник кабатлау
Пестицидлар белән эшкәртелгән борычны тагын бер мисал итеп алыгыз.А заводының эксперимент төркеме өчен, без максатлы ген һәм эчке белешмә ген өчен өч PCR тишек ясадык, ачыкланганнан соң уртача алыр өчен.Plantсемлек белән идарә итү өчен А төркемнәре дә шундый ук мөгамәлә итәләр.Шулай ук, В һәм С үсемлекләре өчен дә шундый ук дәвалау.Бу техник кабатлау.

Әйтергә кирәкстатистикага кергән нәрсә - биологик кабатлау, һәм техник кабатлау - эксперимент процессында очраклы күренешләр булу-булмавын тикшерү, эксперимент нәтиҗәләрен ышанычлы итәр өчен, ягъни без еш әйткәнчә уртача алганда хаталардан саклану.

Тискәре контрольләр - NTC һәм NRT
NTC (Шаблон белән идарә итү юк), шаблонсыз контроль, эксперимент материалның пычранганын тикшерү өчен кулланыла.Гадәттә су шаблон буларак кулланыла.Әгәр дә флюоресцент реакция булса, бу лабораториядә нуклеин кислотасының пычрануы булганын күрсәтә.

Бу пычратулар түбәндәгеләрдән килә: пычрак су, эндоген ДНК булган квалификациясез реагентлар, примерларның пычрануы, лаборатория җиһазларының пычрануы, аэрозол пычрануы һ.б., RNase чүпрәкләрен һәм RNase ингибиторларын кулланырга тиеш.Аэрозол пычрануы табу иң кыен.Лабораториягез томанга охшаган, төрле нуклеин кислоталары һавада туктатылган.

NRT (Кире кире транскрипт), кире транскрипциясез контроль, кире булмаган транскрипцияләнгән РНК тискәре контроль буларак, бу gDNA калдыкларын контрольдә тоту.

Ген экспрессиясен ясаганда, РНК күләме кире транскрипциядән соң cDNA күләмен ачыклап ачыклана.Әгәр дә РНК чистартылганда gDNA калдыклары булса, ул эксперимент нәтиҗәләрендә хаталар китерәчәк, чөнки алынган фактик нәтиҗәләр gDNA һәм cDNA.CDNA гына түгел, гомуми дәрәҗәдә, gDNAны РНК алу вакытында тулысынча бетерергә кирәк.

MIQE (2) - үрнәк мәгълүмат
Ampleрнәк мәгълүмат дип аталган, qPCR турында мәкалә бастырганда, без үрнәк мәгълүматны ачык аңлатырга тиеш, бу мәкаләнең алыштыргысыз өлеше.Нәкъ шулай ук, үрнәкләрне эшкәрткәндә, без үрнәкләрнең дөреслеген тәэмин итү өчен үз операцияләребезне дә көйләргә тиеш.

Ampleрнәкнең тасвирламасы бары тик нәтиҗә, һәм без бөтен эксперимент вакытында алынган материалларга күбрәк игътибар бирергә тиеш.

Эксперименталь материалларны сайлау
Кан үрнәкләре - 4 сәгатьтән артык булмаган яңа кан сайлагыз.Күзәнәк үрнәкләре - көчле үсеш чорында яңа күзәнәкләр җыюны сайлагыз.Хайваннар тукымасы - яңа, көчле үсә торган тукыманы сайлагыз.Antсемлек тукымасы - Яңа, яшь тукыманы сайлагыз.

Сез бу җөмләләрдә төп сүз барлыгын күргәнсездер: яңа.
Aboveгарыдагы үрнәкләр өчен базардагы иң яхшы, чыгымлы һәм тотрыклы комплект - аларның ДНК һәм РНКларын тиз һәм җиңел чыгарып ала торган Foregene комплекты.

Кан ДНК мини комплекты

Күзәнәкнең гомуми РНК изоляциясе комплекты

Хайваннарның гомуми РНК изоляциясе комплекты

Totalсемлекнең гомуми РНК изоляциясе комплекты

Totalсемлекнең гомуми RNA изоляциясе комплекты

ДНК изоляциясе комплекты

Эксперименталь материалларны саклау
Гомумән алганда, шартлар рөхсәт ителсә, без үрнәкләрне сакларга киңәш итмибез.Шулай да, сайлаудан соң ук экспериментлар үткәрә алмаган дуслар бик күп, һәм кайберәүләргә хәтта сыек азот танкларын үрнәк алу өчен кырга алып барырга кирәк.

Мондый эш сөючән дустым өчен мин әйтә алам, сез реагент куллануны аңламыйсыз.Хәзер күп реагент кулланыла торган компанияләр РНК үрнәкләрен бүлмә температурасында саклый ала торган реагентлар җитештерәләр, һәм сез аларны куллана аласыз.Гадәттәге саклау ысулы - сыек азот саклау, йөртү җиңел булган кечкенә сыек азот танкы кулланып.Ampleрнәкне лабораториягә алып кайткач, аны -80 ° C суыткычта саклагыз.

РНК катнашындагы экспериментлар өчен алты сүзле принцип үтәлергә тиеш:түбән температура, ферментлар юк,һәмтиз .

Түбән температура төшенчәсен аңлау җиңел;ферментларсыз, RNase без яшәгән дөньяның бөтен җирендә (югыйсә сез ВИЧ белән үтерелгән булыр идегез), шуңа күрә экспериментлар ясаганда RNaseдан ничек сакланырга кирәк - бик мөһим төшенчә;тиз,Дөньяда Кунг-Фу сындырып булмый, тизлекне генә бозып булмый.

Шуңа күрә, ниндидер мәгънәдә, чыгару вакыты кыскарак, комплект яхшырак.Нигә шулайФоргенкомплекты тизлеккә басым ясый, чөнки алар аны яхшы беләләр.

PS: Кайбер кызлар бик җентекләп экспериментлар ясыйлар, ләкин алар берничә ел эшләгәннән соң чүпрәк кебек яхшы түгел.Алар Алла гаделсез дип саный, башкалардан зарлана һәм тормыш эзли.Чынлыкта, ул моны аңламаган.Ул РНКны яхшы якламады, һәм танк плейеры тиз иде.Эксперимент үткәргәндә, ул өч тапкыр, биш тапкыр һәм ике дивизия белән тәмамланыр дип уйлады, ләкин ул экспериментны яхшы эшләде.

Тамга: Әкренрәк, RNase басып алу мөмкинлеге күбрәк.Yourselfзеңне тиз булырга ничек өйрәтергә?Wayк, күбрәк эшләгез.

Төрле экспериментлар һәм төрле үрнәкләр өчен әле күбрәк әдәбият укырга һәм эшкәртү өчен тиешле ысул сайларга кирәк.Collectionрнәк җыю һәм саклау процессы өчен, MIQE аны кәгазьдә ачык итеп язуны таләп итә, шуңа күрә рецензияләүчеләр кәгазьнең ышанычлылыгын карый алалар, һәм гаҗәпләнгән яшьләр өчен сезнең экспериментны кабатлау уңайлы.

Биологик экспериментлар авыр булса да, алар югары дәрәҗәдә.Әгәр дә сез сак булмасагыз, сез дөньяны аударырга мөмкин.Мәсәлән, SARSны биохимик кризиска әйләндерү, яки 1,3 миллиард кешене коткару өчен гибрид дөге ясау.Түбәндәге рәсем - химик эксперимент, сез аның дик сыман тышкы кыяфәтенә карап кына тикшерүләрегез белән горурлануыгызны аңларга тиеш.Оныт, аны кара итмә.

MIQE (3) - нуклеин кислотасын чыгару.
Нуклеин кислотасын чыгару - зур вакыйга, һәм барлык молекуляр биология экспериментлары нуклеин кислотасын алудан башлана.Беренчедән, әйдәгез, MIQE эчтәлеген нуклеин кислотасы алуда күчерик.

Бу форманы карап, сез биттә кала алмыйсыз.Форма - догма.Иң яхшы студент булу өчен, ни өчен дип сорарга кирәк.Бу таблицаның төп эчтәлеге: ЭзләүРНКның чисталыгы, сафлыгы, эзлеклелеге, чыгару күләме .

Беренче өлешпроцесс яки инструмент - нуклеин кислотасын чыгару адымы.Әгәр сез чыгару өчен автоматик нуклеин кислотасы экстракторын куллансагыз (зинһар, сатып алу өчен миңа мөрәҗәгать итегез), сезгә коралның модель исемен күрсәтергә кирәк.

Комплектның исеме һәм

үзгәртү детальләре өчен нинди комплект кулланылган, нинди махсус реагентлар өстәлгән яки нинди махсус операцияләр эшләнгән, башкалар сезнең экспериментны җиңел кабатлый алсын өчен ачык аңлатылырга тиеш.

Кайбер кешеләр махсус үрнәкләр алганда кайбер махсус реагентлар өстиләр, бу аларның яшерен коралы дип уйлыйлар һәм башкаларга әйтмиләр.Моны сер итеп саклаганда, алар сезнең мәкаләгезне яктырту мөмкинлеген дә югалталар.Акыллы булмагыз, сез фәнни тикшеренүләрдә ил карт Чжанга караганда намуслырак булырга тиеш, акыллы булырга теләсәгез, мәкалә сезне ахмак итәчәк.

комплектның продукт номерын истә тотарга тиешкомплектка заказ биргәндә һәм мәкаләне язганда.Комплектта гадәттә ике сан бар: Мәче - каталог номеры (продукт саны, мәкалә номеры), Лот - продукт лот номеры (продуктның кайсы партиядән килгәнен күрсәтү өчен кулланыла).

Моннан тыш, CAS саны биохимик реагентларга заказ биргәндә еш кулланыла, һәм мин аны популярлаштырачакмын.CAS саны - Америка химия җәмгыяте тарафыннан һәр яңа химик препаратка бирелгән сан.Гадәттә, өч сан сызык белән тоташтырылган.Рушуйның CAS номеры: 7732-18-5.Химик матдәләрнең еш кына кушаматлары бар, ләкин CAS саны уникаль.Даруга заказ биргәндә, аның CAS номерын башта тикшерә аласыз.

Өйгә якынрак, нигә без бу әйберләрне ачык итеп сурәтләргә тиеш?Чынлыкта, ул шулай ук ​​РНК алу сыйфатын тикшерү.Приборлар һәм комплектлар куллану РНК чыгаруны тагын да эзлекле итәчәк.Гади лабораторияләрнең чыгару масштабы зур түгел, һәм аны комплектлар белән алырга мөмкин.

DNase яки RNase дәвалау детальләре
Флуоресцент санлы PCR-ның мөһим проблемасы - ДНК пычрануын булдырмау, һәм пычрану булса, эксперимент ясамагыз.Шуңа күрә, эксперимент процессындагы ДНКның тулысынча һәм тулысынча бетерелүен күрсәтү өчен, сез ДНКны эшкәртү өчен кулланган процессны әйтергә кирәк.схематик схема белән күрсәтелгән.

РНК һәм ДНКның схематик схемасы
Гомумән, ДНКны чыгару ысулы - РНКны DNase белән эшкәртүдән соң дәвалау.Ләкин, бу чагыштырмача иске ысуллар.Коммерция РНК чыгару комплектлары DNase кушмыйча чыгару процессында ДНКны бетерә алды.Мәсәлән, Форгеннан комплектлар.

Тамга: РНК алу вакытында ДНКны чыгару - бик куркыныч ике кырлы кылыч, ул РНКны чыгару вакытын озайтачак һәм РНК деградациясен арттырачак.Нигездә, бу РНК уңышы һәм чисталыгы арасында сәүдә.

Моннан тыш, кремнийга нигезләнгән adsorption баганасына кушылган DNase күләме бик аз, һәм эффектка ирешү өчен югары сыйфатлы DNase кулланылырга тиеш.Популяр булмаган DNase тиз һәм тулысынча үзләштерелми.Бу сәүдәгәрнең техник дәрәҗәсен сынау.Әлбәттә, ДНКны DNaseсыз алып була дип мактанучы тагын да сәер сәүдәгәрләр бар.ДНКсыз тулысынча ДНКны бетереп була дип мактанган кеше - хулиган.ДНК - чагыштырмача тотрыклы ике катлы структура, һәм аны сөйләшү һәм көлү белән генә бетереп булмый.

Пычратуны бәяләү
бәяләү ысулы: электрофорезны ачыклау, 1% агароза, 6В / см, 15мин, йөкләү 1-3 ул

Нуклеин кислотасының санлы анализы
гадәттә UV спектропотометры белән үлчәнәләр.Башта OD260, OD280, OD230 өч кыйммәтенең мәгънәсен популярлаштырырга рөхсәт итегез.
· OD260nm: Бу нуклеин кислотасының иң югары үзләштерү иң югары үзләштерү дулкын озынлыгы, һәм иң яхшы үлчәнгән кыйммәт 0,1 дән 1,0 га кадәр.Notк икән, үрнәкне эретегез яки туплагыз.
· OD280nm: Бу протеин һәм фенолик матдәләрнең иң югары үзләштерү чокының үзләштерү дулкын озынлыгы.
· OD230nm: Бу углеводларның иң югары үзләштерү чокының үзләштерү дулкын озынлыгы.

Алга таба, һәр күрсәткечнең роле турында сөйләшик.A260 өчен аны нуклеин кислотасының уңышын үлчәү өчен кулланырга мөмкин.OD260 = 1 булганда, dsDNA = 50μg / мл, ssDNA = 37μg / мл, RNA = 40μg / мл.

Чисталык өчен без гадәттә күргән нисбәтләрне карарга тиеш: OD260 / 280 һәм OD260 / 230.
Чиста ДНК: OD260 / 280 якынча 1,8гә тигез.1,9-тан зуррак булганда, ул РНК пычрануы барлыгын күрсәтә, һәм 1,6-тан ким булганда, белок һәм фенол пычрануы барлыгын күрсәтә.
Чиста РНК: 1.7
· OD260 / 230: ДНКмы, РНКмы, белешмә бәясе 2,5.2,0-тан ким булганда, шикәр, тоз һәм органик матдәләр пычрануын күрсәтә.

РНК бөтенлеге

РНКның бөтенлеген үлчәү бик мөһим.Гадәттә, 28S белән 18S РНК арасындагы яктылыкның ике катлы бәйләнеш булуын тикшерү өчен РНК денатурация гел эксперименты ясарга кирәк.Өченче группа 5S пәйда булгач, умырткасыз хайваннардан кала, РНК начарлана башлады.

РНК сыйфатын бәяләү өчен мәгълүмат: aboveгарыдагы тестларга өстәп, РНК бөтенлеге ягыннан тагын да алдынгы инструмент тестлары бар, мәсәлән, РНКның күзгә күренеп деградацияләнүен ачыклый торган Эксперимент автоматик электрофорез системасының RQI бөтенлеге тесты.

Фәнни тикшеренүләрдә флюоресцент санлы PCR - максатлы ген белән эчке белешмә ген арасында чагыштыру.Шуңа күрә, РНК үрнәген саклау, РНК чыгару һ.б. процессында төп максат - РНКның бөтенлеген тәэмин итү.

РНКның бөтенлеге максатлы ген белән эчке белешмә ген арасындагы баланска ничек тәэсир итә, астагы рәсемнән җиңел аңлашыла.Деградация генның тулы булмавына китерәчәк, эчке белешмә генның тулы булмавы яки максатлы генның тулы булмавы, бу мәгълүматларга зур йогынты ясаячак.

Максатлы ген һәм белешмә генның схематик схемасы дөрес булырга тиеш түгел

Тыю тесты (КТ бәясе югары яки түбән концентрациядә яки башка шартларда кысыламы)

Бу фигураны мисал итеп алсак, биш кәкренең Ct кыйммәтләре түбәндәгечә.КТ кыйммәтләренең кәкреләр арасында бүленеше тигез түгел, һәм Ct кыйммәтләре югары һәм түбән концентрацияләр астында тоткарлана, бу PCR тыю очраклары.

Төп фикер: РНК алу процессында безгә ялгыш карашлардан баш тартырга һәм дөрес карашларны булдырырга кирәк.

Ялгыш идея: РНК чыгару уңышны гына дәвам итә, алынган РНК күләме шулкадәр яхшырак дип уйлап.Чынлыкта, без сан ясаганда, геннар саны бик күп булмаса, безгә РНК кирәк түгел.Сез чыгарган РНК күләме җитәрлек түгел.

Дөрес төшенчә:РНК чыгару чисталыкка, сафлыкка һәм эзлеклелеккә омтылырга тиеш.Чисталык алдагы кире транскрипциянең тыелмавын һәм мәгълүматларның ДНК тәэсиренә китермәвен тәэмин итә ала.Сафлык максатчан эзлеклелек һәм эчке сылтамалар балансын тәэмин итә.Эзлеклелек үрнәк үрнәкне йөкләүне тәэмин итә.

MIQE (4) - кире транскрипция
Ялгыш караш: югары үрнәк күләменә омтылу.
Дөрес төшенчә: Эзләү эзлеклелеге (тотрыклылык), йөкләнгән РНК күләменә карамастан, кире транскрипциянең эффективлыгы эзлекле булып кала, cDNAдагы аермалар mRNAдагы аермаларны чыннан да чагылдыра ала.
Бу процессны схематик схема белән аңлатабыз:

Кире транскрипция эффективлыгының схематик схемасы дөрес булмас
Беренчедән, кире транскрипция процессы белән PCR процессы арасындагы аерманы аңларга кирәк.PCR берничә җылыту һәм яндыру процессын уза, һәм максат фрагменты тиз арада үсә;кире транскрипциядә бу процесс булмаса да, без кире транскрипциянең чынбарлыкта бердән-бер булуын күз алдыбызга китерә алабыз.

CDNA мәгълүматының күп кисәкләрен ала алганга, аны хәзер аңларга кирәк, чөнки зур һәм кечкенә фрагментлар кире транскрипцияләнгән, һәм бер фрагментка игътибар итү мөмкин түгел.Rәм РНК күләме чагыштырмача аз булганлыктан, алынган CDNA күләме дә чагыштырмача кечкенә, PCRдан аермалы буларак, көчәйтү эффекты бар, шуңа күрә аны табу мөмкин түгел.

cDNA электрофорез нәтиҗәләре
Икенчедән, идеаль, кире транскрипция бер-бер артлы башкарыла, ләкин бу эффектка бернинди компаниядән дә кире транскриптаз ирешә алмый.Нигездә, күпчелек кире транскриптларның эффективлыгы 30-50% арасында йөри.Бу очракта без чагыштырмача тотрыклы кире транскрипция эффективлыгына ия булыр идек, бу без рәсемдә күрергә теләгән әйбер: 3 РНК 2 CDNA ала, 6 РНК 4 CDNA ала, шуңа күрә күпме үрнәк йөкләнсә дә, кире транскрипция эффективлыгы чагыштырмача тотрыклы.Кире транскрипция эффективлыгы тотрыксыз һәм югары концентрация тыелган ситуацияне күрәсе килми.

Шулай итеп, кире транскрипция эффективлыгы тотрыклы булуын ничек тикшерергә?Метод бик гади, сезгә чагыштыру тесты гына ясарга кирәк: берсе - РНКны икеләтә эреткәннән соң CDNAга кире транскрипцияләү, икенчесе - CDNAга кире транскрипциядән соң икеләтә эретү, аннары алынган кырны күрү өчен qPCR эшләве эзлеклеме?Иң яхшы студент буларак, сез аны секундларда аңларга тиеш.Түбәндә күрсәтелгәнчә:

Кире транскрипциянең эффективлыгын тикшерү өчен РНК һәм cDNA эретү
Кире транскриптаз һәм комплект
Ничек камил флуоресцент санлы PCR искиткеч кире транскриптаз һәм комплектка ия ​​була ала.Кире транскриптаз чыганак буенча AMV яки ике төргә бүленәМ-МЛВ, һәм аларның күрсәткечләре таблицада күрсәтелгән кебек.

RNase H эшчәнлеге
RNase H - Ribonuclease H, Кытай исеме - рибонуклаз H, ул ДНК-РНК гибрид чылбырында РНКны гидролизлый ала торган эндорибонуклаз.RNase H фосфодистер бәйләнешләрен бер полосалы яки ике катлы ДНК яки РНКда гидролизацияли алмый, ягъни бер катлы яки ике катлы ДНК яки РНКны сеңдерә алмый.CDNAның икенче полосасы синтезында еш кулланыла.

Бу сәер нәрсә.Кире транскриптазның RNase H активлыгы бар, кире транскриптазда RNase H бар дигән сүз түгел, һәм RNase H-ны кире транскриптаздан аеру мөмкин түгел, бәлки кире транскриптаздагы кайбер төркемнәрнең конформациясе аркасында. Бу эшчәнлек кире транскриптаз аркасында килеп чыккан.

Шуңа күрә, AMV-ның кире транскрипция эффективлыгына карамастан, аның RNase H эшчәнлеге cDNA уңышын киметә.Әлбәттә, реагент җитештерүчеләр үз продуктларын оптимальләштерәләр, RNase H активлыгын кире транскриптазда бетерү өчен, cDNA җитештерүчәнлеген арттыру өчен.
Температура

Төрле температурада РНКның икенчел структурасы
Төрле температурада РНКның икенчел структурасы өчен югарыдагы рәсемне карагыз, һәм билгеле температура һәм тоз концентрациясе шартларында максат фрагментының икенчел структурасын билгеләү өчен mFold онлайн коралын кулланыгыз.55 ° C температурада РНКның икенчел структурасы әле бик катлаулы, кире транскриптаз эшли алмый, һәм икенчел структура 65 ° C кадәр тулысынча хәл ителми, шул ук вакытта AMV һәм M-MLV оптималь температурасы бу температурадан күпкә түбән.
нишләргә?Икенчел структура - шаблонның тулыландыргыч парлашуы, бу праймер белән кире транскриптаз һәм шаблон арасында көчле көндәшлеккә китерә, нәтиҗәдә E түбән һәм начар кабатлану кебек проблемалар сериясенә китерә.

нишләргә?Анналь температураны мөмкин кадәр арттырыгыз.

Күпчелек реагент җитештерүчеләр кире транскриптазны генетик инженерия ярдәмендә яхшырталар.Кайберәүләр Джифан һәм Айделай кебек реакция температурасын күтәрәләр, һәм кайберәүләр фермент белән РНК шаблоны арасындагы якынлыкны яхшырту өчен RNase H ферментының актив төркемен чыгаралар.Affгары якынлык икенчел структураны конкурентлык белән кысып, шома укып, шулай ук ​​кире транскрипциянең эффективлыгын яхшырта ала.
Төп фикер: Кире транскрипция кире транскрипция эффективлыгының эзлеклелеген эзләү өчен мөһимрәк (ферментлар эффектив булырга тиеш түгел, ә тотрыклы булырга тиеш), йөкләнгән үрнәк күләме түгел, ә аеруча зур масштаблы флуоресцент санлы PCR булмаса, бу бөтенләй мөмкин түгел.Берничә CDNA.
Төрле җитештерүчеләр эзлеклелек эзләүдә дә күп көч куйдылар.Мәсәлән, күпчелек компанияләр кире транскрипцияне сату өчен стандарт комплект итеп тутырдылар, бу яхшы сайлау.
Мәсәлән, Foregene's RT Easy Series комплектлары:

RT Easy I (cDNA синтезы комплекты өчен мастер премикс)

MIQE (5) - максатлы ген турында мәгълүмат

Aboveгарыдагы рәсем аңлатыла
1. Бу ген кабатланган экспериментлар өчен эффективмы, гадәттә кабатланган экспериментлар ярдәмендә расланырга мөмкин.
2. Ген ID, беләсезме.
3. Ген озынлыгы, максатлы генның гомуми озынлыгы, әлбәттә, проблема түгел.Праймерларны эшләгәндә, яхшырак көчәйтү эффективлыгын тәэмин итү өчен, ампликонның озынлыгы 80-200bp арасында булуына инаныгыз.
4. Эзләү шартлау чагыштыру мәгълүматы, максатчан генны махсус булмаган көчәйтүдән саклап калу өчен, генбанкта чагыштырырга кирәк.
5. Псевдогеннар булу.Псевдоген - гадәти генга охшаган ДНК эзлеклелеге, ләкин нормаль функциясен югалта.Еукариотларның күп генлы гаиләсендә ул еш очрый.Бу гадәттә by белән күрсәтелә.Бу геномдагы функциональ булмаган геном ДНК күчермәсе, ул кодлаштыру ген эзлеклелегенә бик охшаган., гадәттә транскрипцияләнмәгән, һәм ачык физиологик мәгънә юк.
6. Экзоннарга һәм интроннарга караганда праймерларның позициясе.Беренче елларда, без ДНК пычрану проблемасын чишкәндә, без еш кына праймериз, экзон һәм интрон позицияләренә игътибар иттек, һәм, гадәттә, ДНК көчәйтүдән саклану өчен, интрон аша праймериз ясарга уйладык.Зинһар, астагы рәсемне карагыз: кара интроннарны, төрле блюзлар экзоннарны, алсу кызыл гомуми праймерларны, ачык кызыл төстәге примерларны күрсәтә.

Схематик, беркайчан да дөрес түгел
Бу нинди яхшы план кебек тоела, ләкин, күпчелек очракта, транс-интрон праймерлары күз алдына китерелгәнчә тылсымлы түгел, һәм алар махсус булмаган көчәйтүгә китерәчәк.Шуңа күрә ДНК пычрануының иң яхшы ысулы - ДНКны тулысынча бетерү.
7. Конформацияне фаразлау.Бу мисалны кабат кулланып, билгеле бер температурада һәм тоз концентрациясендә максат фрагментының икенчел структурасын билгеләү өчен mFold онлайн коралын кулланыгыз.

Төрле температурада РНКның икенчел структурасы
Икенчел структура - шаблонның тулыландыргыч парлашуы, бу праймер белән шаблон парлашуы арасында көчле көндәшлеккә китерәчәк, һәм праймерны бәйләү мөмкинлеге азрак, нәтиҗәдә E түбән һәм начар кабатлану кебек проблемалар сериясенә китерә.Программаны фаразлау аша, икенчел структура проблемасы булмаса, бу бик яхшы булыр иде.Әгәр дә бар икән, безнең алдагы мәкалә бу проблеманы ничек чишү турында махсус сөйләшәчәк.

MIQE (6) —qPCR Олигонуклеотидлар

Флуоресцент санлы PCR өчен, сез көн саен көрәшкән беренче нәрсә - РНК чыгару, икенчесе - праймериз.
Беренчедән, без әле MIQE тикшерү исемлеге буенча праймериз дизайны кагыйдәләрен тикшерәбез.Бу бик гади, чүпрәкләр көлергә мөмкин, һәм без аны бер җөмләдә тәмамлый алабыз: праймеризның эзлеклелеген һәм торышын һәм модификация ысулын табыгыз.Праймерны чистарту ысулы өчен пример синтезы хәзерге вакытта бик арзан, qPCR PAGE һәм чистарту ысулларына лаек, һәм синтез коралы турында мәгълүмат мөһим түгел.Күпчелек кеше дистә еллар дәвамында праймериз белән шөгыльләнә һәм синтезаторның ABI3900 икәнен белми.
Праймер дизайны принципларына килгәндә, сез аларны яттан ятларга тиеш түгел, чөнки күпчелек праймериз дизайн программалары яки онлайн кораллар бу проблемалар турында кайгырта алалар (тәкъдим ителгән онлайн корал primer3.ut.ee/), һәм пример дизайнының 99,999% кул белән эшләнми Карагыз, автор кайвакыт көненә йөзләгән праймер ясый, бер-бер артлы укысагыз, ул күзгә әйләнәчәк.
Праймерлар эшләнгәннән соң түбәндәге пунктларны тикшерегез:
1. 3 ′ ахырына якын проектлау праймериз: Олиго dT праймерларын cDNA беренче катлы синтез өчен кулланган очракта, кире транскрипция эффективлыгын һәм РНК бөтенлеген исәпкә алып, көчәйтелгән эффективлыкны яхшырту өчен эшләнгән праймериз 3 ′ ахырына якын эшләнергә тиеш.Түбәндәгечә аңлату өчен рәсем кулланыгыз (моны аңларга мөмкинлек юк):

Ни өчен праймериз 3 ′ ахырына якын эшләнергә тиеш, бу дөрес булмаска тиеш
2. ТМ кыйммәте: ТМ бәясе 55-65 ° C (чөнки экзонуклаз активлыгы иң югары 60 ° C), һәм GC эчтәлеге 40% -60% тәшкил итә.
3. ПЛАСТ: Геномның специаль булмаган көчәйтүен булдырмас өчен, өстәмә тикшерү өчен шартлау кулланылырга тиеш.

MIQE (7) —qPCR процессы

1. qPCR комплекты
MIQE таләпләре буенча, без мәкаләдәге тулы реакция шартларын, шул исәптән PCR реакция системасы конфигурациясен, нинди комплект кулланылганын, җитештерүче, реакция системасының никадәр зур булуын, буяу ысулы яки тикшерү ысулы кулланылганын, PCR программа көйләнмәләрен ачык итеп сурәтләргә тиеш.Ветеран машина йөртүчеләр, һичшиксез, комплект сайланса, югарыдагы мәгълүмат нигездә билгеләнәчәк.
Хәзерге вакытта флюоресцент санлы PCR комплектларын җитештерү һәм җитештерү - бик җитлеккән технология.Сез бик начар җитештерүчеләрне сайламасагыз, проблемалар ихтималы зур түгел, ләкин без сезнең белән берничә пункт белән уртаклашасыбыз килә:
Кайнар старт Так ферменты:PCR-ның иң мөһим өлеше - кайнар старт Так ферменты.Базардагы кайнар старт ферментлары, гадәттә, ике төргә бүленәләр, берсе - химик үзгәртелгән кайнар старт ферменты (сез аны парафин урнаштыру дип күз алдыгызга китерә аласыз), икенчесе - антитела модификациясе өчен кайнар башлангыч фермент (антиген-антитела бәйләү).Химик модификация - кайнар башлангыч ферментларның башлангыч ысулы.Билгеле температура җиткәч, фермент аның эшчәнлеген җибәрәчәк.Антитело үзгәртелгән кайнар фермент биологик ысуллар куллана, ферментның эшчәнлеген блоклый.Билгеле температура җиткәч, антитела денатурацияләнәчәк һәм протеин буларак инактивлаштырылачак, һәм фермент активлыгы уйныйчак.

Ләкин моның нинди файдасы бар?Бу очракта, антитело үзгәртелгән ферментларның чыгару активлыгы химик үзгәртелгән ферментларга караганда тизрәк, шуңа күрә сизгерлек ягыннан, антитела үзгәртелгән ферментлар бераз өстенлеккә ия, шуңа күрә базар комплектларында химик үзгәртелгән ферментлар юк.Әгәр дә бар икән, димәк, бу җитештерүченең технологиясе меңьеллык чорында калган.
Магний ион концентрациясе:PCR реакциясендә магний ион концентрациясе бик мөһим.Тиешле магний ион концентрациясе Так ферментының активлыгын чыгарырга ярдәм итә ала.Концентрация бик түбән булса, ферментларның активлыгы сизелерлек кимиячәк;концентрациясе артык зур булса, фермент-катализатор специфик булмаган көчәйтү көчәйтеләчәк.Магний ионнары концентрациясе шулай ук ​​примерларның аннальләшүенә, шаблонның эрү температурасына һәм PCR продуктларына тәэсир итәчәк, шуның белән көчәйтелгән фрагментларның уңышына тәэсир итәчәк.Магний ионнары концентрациясе гадәттә 25мм белән контрольдә тотыла.Әлбәттә, яхшы комплект өчен магний ионнары концентрациясе яхшы контрольдә тотылырга тиеш.Кайбер сәүдәгәрләр реагентка магний ионын эретүче агент өстиләр, бу магний ион концентрациясен автоматик көйләү эффектына ирешә ала.
Флюоресцент буяу концентрациясе:Без гадәттә кулланган SYBR Яшел флуоресцент буяу, нигездә, ике катлы ДНКның кечкенә трубкасына бәйләп флуоресцентлык тудыра, чөнки буяуны ике катлы ДНК белән бәйләү специфик түгел, ягъни ике катлы ДНК аның белән кушылса, флюоресенция барлыкка килергә мөмкин, шуңа күрә системада пример-димерлар һәм ДНК шаблоннары кушылыр.
PS: Яктылыкка сизгер характеристикалары аркасында, базардагы продуктлар, гадәттә, ачык булмаган центрифуга торбаларына төрелгән (астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә).Ләкин бу проблема белән очрашачак.Samрнәк алганда сыеклыкның соралганын күрү кыен.Бу яктан, ingинке чыннан да кулланучыларга иң уңайлы (астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә), һәм үтә күренмәле труба ачык булмаган калай капчыкка салынган.Аннары, яктылыктан һәм үрнәк алудан саклану уңайлыгын исәпкә алып, аны калай капчыкка салыгыз.Сез дөрес продукт номерын сайларга тиеш.TSE204 - үлән утыртырга теләгән супер чыгымлы эффектив яшәү.

Флуоресцент буяуның концентрациясе дә бик мөһим.Концентрация бик түбән булса, көчәйтү сызыгы соңгы этапта күтәрелмәячәк һәм камил түгел;концентрациясе артык зур булса, ул шау-шу комачаулый.Флуоресцент санлы PCR, нигездә, КТ бәясенә бәйле булганлыктан, флюоресцент буяуның концентрациясе дөрес көйләнмәсә, түбән нокта югары ноктага караганда яхшырак.Әлбәттә, буяуның тиешле концентрациясе иң яхшысы.

ROX: ROX буяулары яхшы флюоресенция сигнал хаталарын төзәтү өчен кулланыла.Кайбер прибор җитештерүчеләре калибрлау таләп итә, икенчеләре таләп итми.Мәсәлән, Термо Фишер Фәнни Реаль Вакыт PCR көчәйтү коралын куллану гадәттә калибрлау таләп итә, шул исәптән 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus һ.б. Гомуми комплект күрсәтмәләре аны тасвирлый.
Foregene's qPCR Mix шулай ук ​​ROX буяуны үз эченә ала, ул төрле модельләрдә куллану өчен уңайлы.

Реаль Вакыт PCR Кит-Такман

Зәгыйфь водород бәйләнешен эшкәртү: Зәгыйфь водород бәйләнешләрен дәвалау чагыштырмача техник эш.Күп комплектларның кулланмаларын бернәрсә дә укымады, ләкин аларның берсе дә бу теманы искә алмады.Чынлыкта, бу бик мөһим.Базаларның берләшүе, нигездә, водород бәйләнешләренең көченә бәйле.Көчле водород бәйләнеше - нормаль көчәйтү, ә зәгыйфь водород бәйләнеше махсус булмаган көчәйтүгә китерә.Зәгыйфь водород бәйләнешләрен яхшы бетереп булмаса, специфик булмаган көчәйтүдән сакланып булмый.Автор кысаларында бу проблеманы берничә компания генә күрде.Комплектны сатып алгач, сез сайларга теләгән комплект өчен бу карарны чишү турында уйлаганыгызны күрсәтә аласыз.

Реакция күләме: 20-50ул системасы еш кулланыла, һәм кечерәк күләмнәр хаталар китерергә мөмкин.Гомумән алганда, комплект күрсәтмәләре PCR реакция күләмнәрен кулланырга тәкъдим итәчәк.Акыллы булмагыз һәм чыгымнарны экономияләү өчен кечерәк күләмнәрне кулланыгыз.максаты.Сәүдәгәрләр тәкъдим иткән күләм чыннан да сынап каралган, һәм алар кечкенә күләмле хаталар проблемасын чишә алмаганнардыр.
2. Труба тәлинкәсенең җитештерүче һәм мәкалә саны
Флюоресцент санлы PCR принцибын һәркем белә.Флуоресцент җыю, нигездә, PCR трубка капкалары аша башкарыла.PCR куллану материалларын сайлаганда, ике пунктка игътибар итегез: яхшы яктылык тапшыру һәм корал өчен яраклы.Гомумән алганда, төп брендларның такталары һәм трубалары яхшы, ләкин сез адаптация ягыннан җентекләп сайларга тиеш, югыйсә сез коралны куллана алмассыз.

4. levelгары дәрәҗәдәге белем

MIQE (8) —qPCR тикшерү
Бу qPCRның төп өстенлеге!Бик күп геройлар монда комга төштеләр.Әлбәттә, сезнең бәхетле булуыгыз да мөмкин, һәм сез өйрәнгән геннар гади, шуңа күрә сез боз куышында җил буйлап йөзеп йөрдегез.QPCR-ның тикшерү мәгълүматлары мәгълүматның ышанычлылыгын сынау өчен.Без кирәкле тикшерү мәгълүматларын түбәндәгечә күрсәтәбез:

1.Сыйфат тесты
Максатлы ген көчәйтүнең үзенчәлеге электрофорез картинасының бер полоса булуын тикшереп тикшерелә;эзлекле тикшерү;иң югары картаның бер булу-булмавын эретү сызыгы;ферментларның ашкайнатуны тикшерү һәм башка ысуллар.
Монда без ткәкреләрне эретү ысулын кулланып, специаль булмаган көчәйтү анализы.Гомумән алганда, без праймерларны эшләгәндә, продукт фрагментының күләме 80-200bp диапазонында булырга тиеш, бу PCR продуктының эрү температурасын 80-85 ° C диапазонына китерә.Шуңа күрә, төрле чокырлар булса, башка специаль булмаган көчәйтү продуктлары булырга тиеш;иң югары 80 ° C-тан түбән күренсә, ул гадәттә пример димеры булып санала;иң югарысы 85 ° C-тан югары булса, ул гадәттә ДНК пычрануы яки зур фрагментларның билгесез көчәйтүе булып санала.
Искәрмә: Кайвакыт 80 ° C температурада бер генә биеклек бар.Бу вакытта бу концепция үтәлергә тиеш.Күрәсең, көчәйтү нәтиҗәләре барысы да пример үлчәмнәре.

Нормаль эретү сызыгы (специфик көчәйткеч булмаган бер биеклек)

Проблемалы эретү сызыгы (спирт булмаган көчәйтү көче)
【Эш анализы】

Төп чокыр бар, ләкин пример димеры җитди
Түбәндәге рәсемдә бер-бер артлы эрү сызыгы күзләрегезне җиңел генә алдата, бу бик яхшы эксперимент, ләкин нәтиҗәсе бөтенләй дөрес түгел.Бу вакытта без эрү температурасын карарга тиеш.Иң югары температура 80 ° C-тан түбән, ул тулысынча пример-димер.

Максатлы фрагмент юк, барлык пример үлчәмнәре
Монда абыем туктый алмый.Түбәндәге рәсем миңа кәрәзле телефон белән җибәрелгән фото.Ул кулланган реагентлар - сәнәгатьтә еш кулланыла торган брендлар.Ул бер Т-префикс брендыннан икенче T-префикс брендына үзгәрде.Сез моны чамалыйсыз дип уйлыйм.Чүпрәле миңа кычкырды: “Беренче рәсемдә кулланылган реагент бик яхшы, һәм иң югары.Соңрак, сез тәкъдим иткән реагентны кулланганнан соң, ул катнаш рәсемнәр белән икенче рәсемгә охшаган.Син мине аяныч иттең."
Ике графикны аерыгыз.Беренче карашка, берсенең иң югары ноктасы, икенчесенең икеләтә биеклеге бар.Нонсенс, бер биеклек, әлбәттә.Бу дөресме?
Dou E-тан начаррак, ике рәсемне астагы рәсемгә куйсам, сез шунда ук аңларсыз.Чынлыкта, без мондый рәсем белән җиңел параличланабыз.Игътибарлы анализ ясаганнан соң, без ачыкладык: беренче фигураның иң югары ноктасы - 75 ° C, ул тулысынча пример димер;икенче фигураның иң югары ноктасы 75 ° C һәм 82 ° C, ким дигәндә продукт барлыкка килә.

Студентларның фикерләре
Димәк, төп проблема реагентлар проблемасы түгел, ә пример дизайны проблемасы.Шул ук вакытта, ул шулай ук ​​кайбер зур брендларның тимер сыйфаты булмаганын исбатлый, һәм шулай ук ​​абыемның әйткәнен раслый: Сезнең мәкаләгезне реагент бренды түгел.Бу сезнең мәкалә реагентлар брендын тәкъдим итте.Күз алдыгызга китерегез, чүпрәк реагентларны үзгәртмәсә, дөрес булмаган мәгълүмат журналга җибәрелер иде, һәм нәрсә булачагы фаҗига булыр иде.
2. Буш контрольнең Ct бәясе
Аңлатмагыз, буш контроль Ct кыйммәте булса, ул пычрану түгелме?Шулай да, нинди буш контрольнең Ct кыйммәте барлыгын аңларга кирәк.Әгәр дә ул NTC булса, димәк, реагент пычрану кебек чит ДНК бар.Әгәр дә ул NRT булса, димәк, алынган РНКның ДНК пычрануы бар.
3. Стандарт сызык
Килеш һәм исәпләү формуласын кертеп, PCR эффективлыгын формула аша исәпләргә мөмкин.Камил эксперимент стандарт кәкре кыры 3.32, R² 0.9999 якынлашуны таләп итә.
4. Сызыклы динамик диапазон
Реакциянең динамик диапазоны сызыклы.Стандарт сызык ясау өчен кулланылган шаблон буенча, динамик диапазон ким дигәндә 5 концентрация градиентын кертергә тиеш, һәм югары концентрацияле градиентларда һәм түбән концентрацияле градиентларда Ct кыйммәтләренең үзгәрүенә игътибар итергә тиеш.
5. Ачыклау төгәллеге
QPCR нәтиҗәләренең үзгәрүе, ягъни начар кабатлану, ягъни төгәл төгәллек күп температуралар, концентрация һәм эксплуатация аркасында килеп чыга.qPCR төгәллеге, гадәттә, күчерелмә саны кимегәндә азрак контрольдә тотыла.Идеаль рәвештә эксперименталь вариация, бу техник үзгәреш биологик үзгәрүдән аерылып торырга тиеш, һәм биологик репликалар төркемнәр яки дәвалау арасындагы qPCR нәтиҗәләрендәге статистик аермаларны турыдан-туры чишә ала.Аерым алганда, диагностик анализлар өчен, сайтлар һәм операторлар арасында иң яхшы аналитик төгәллек (кабатлану) хәбәр ителергә тиеш.
6. Ачыклау эффективлыгы һәм LOD (мультиплекс qPCRда)
LOD - ачыкланган уңай үрнәкләрнең 95% иң түбән концентрациясе.Башка сүзләр белән әйткәндә, максатлы ген репликалары җыелмасында булган LOD концентрациясе уңышсыз реакцияләрнең 5% тан артмаска тиеш.Мультиплекслы qPCR анализ ясаганда, аеруча нокта мутацияләрен яки полиморфизмнарны бер үк вакытта ачыклау өчен, мультиплекс qPCR бер үк трубада берничә максатлы фрагментларның төгәллеге бозылмаганын, күп ачыклау һәм бер трубаны ачыклау эффективлыгы һәм LOD бер үк булырга тиешлеген расларга тиеш.Бигрәк тә югары концентрацияле максатлы геннар һәм аз концентрацияле максатлы геннар бер үк вакытта көчәйтелгәндә, бу проблемага игътибар ителергә тиеш.
Проблемалар һәм чишелешләрГомумән алганда, qPCR көйләүдә еш очрый торган проблемалар түбәндәге аспектларга юнәлтелгән:
· Билгесез көчәйтү
· Праймер концентрациясен сайлау авыр, праймер-димерлар белән проблема
· Анналь температурасы дөрес түгел
· Икенчел структура көчәйтү эффективлыгына тәэсир итә
билгесез көчәйтү
специаль булмаган көчәйтүкилеп чыга, гадәттә праймериз дизайны яраксызмы-юкмы дип санала, ләкин праймерларны үзгәртергә ашыкмасаң, башта түбәндәге ысулларны кулланып карый аласың (принцип шулай ук ​​бәйләнгән):
· Анналь температураны күтәрү - зәгыйфь водород бәйләнешләрен саклап кала алмаска тырышыгыз;
· Аннальинг һәм озынлык вакытын кыскарту - зәгыйфь водород бәйләнешләрен киметү;
· Праймер концентрациясен киметү - артык примерларны һәм максатсыз регионнарны бәйләү мөмкинлеген киметү;
Түбән көчәйтү эффективлыгы
Конкрет булмаган көчәйтүнең капма-каршы ситуациясе - түбән көчәйтү эффективлыгы, һәм түбән көчәйтү эффективлыгы белән эш итү чаралары киресенчә:
· Аннальинг һәм озайту вакытын озайту;
· Өч этаплы PCRга үзгәрү һәм анналь температураны киметү;
· Праймер концентрациясен арттыру;
Ps.Проблеманы җиңел чишү өчен, ахмаклар зәгыйфь водород бәйләнешләрен сеңдерүче фактор бармы-юкмы икәнен белү өчен реагент компаниясен кертүне укырга тиешләр.
Праймер концентрациясен сайлау һәм праймер-димерлар белән проблема
Метод 1: Гомумән алганда, qPCR өчен комплект күрсәтмәләре системаларны тәкъдим иттеләр һәм пример концентрацияләрен тәкъдим иттеләр.
Метод 2: Праймер концентрация градиентын куеп төзәтү.Түбәндәге рәсем иллюстрацияләү өчен компаниядән урланган.Түбәндәге рәсемдә өч пример концентрация градиенты (100nM, 250nM, 500nM) һәм дүрт шаблон концентрация градиентлары белән ясалган флуоресцент санлы нәтиҗәләр күрсәтелә (0,1нг, 1нг, 10нг, 100нг).Эксперименталь нәтиҗәләрнең Ct бәясе түбәндәгечә планлаштырылган:

Праймер концентрациясен сайлау eachәрбер праймер концентрациясен түбәндәгечә сызыкка бәйләгез:

Праймер концентрациясен сайлау ачык, 100нМ һәм 250нМ пример концентрациясенең сызыклы бәйләнеше яхшырак, һәм 500нМ пример концентрациясенең сызыклы бәйләнеше чагыштырмача начар.100nM һәм 250nM, Ct бәясе 250nM чагыштырмача кечкенә, шуңа күрә оптималь пример концентрациясе 250nM.Гадәттә каты пример-үлчәмнәр эретү сызыгында күренергә мөмкин.Дизайнланган праймерлар праймер-димерлардан кача алмасалар, нәрсә эшләргә?
3 нче ысул: Праймерлар күләмен киметү һәм аннальинг температурасын арттыру (аңлатырга кирәкми).
Анналь температураның эмпирик кыйммәте 60 ° C.Әгәр дә сез ышанмасагыз, аннальинг температурасын ничек сайларга?Primавап пример концентрациясен сайлау белән бер үк -градиент тест.Проблеманы күрсәтү өчен био-рад компаниясеннән рәсем алыгыз.Билгеле бер фрагментны көчәйтү өчен, сигез температура градиентын куегыз, аларның һәрберсе өч тапкыр кабатлана, һәм алынган көчәйтү сызыгы түбәндәгечә:

аннальинг температурасын сайлау:
· 70 ° C, 69 ° C - Праймерларны берләштереп булмый, шуңа күрә көчәйтү юк.
· 67.3 ° C - Башта аз күләмдә көчәйтү бар, һәм Ct бәясе чагыштырмача зур.
· 64,5 ° C —— Ct бәясе кими.
· 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C, һәм 55,0 ° C булганда, Ct кыйммәтләре тотрыклы булырга омтылды, ләкин соңгы флюоресенция кыйммәтләре төрле иде.
Ничек сайларга?Принцип: Беренче принцип - югары Ct кыйммәте.Шул ук Ct кыйммәте өчен, димеризациядән һәм специаль булмаган көчәйтүдән саклану өчен, югарырак аннальинг температурасын сайлагыз.55 ° C температурада югарырак флюоресенция кыйммәте булса да, анда үлчәмнәр яки специаль булмаган көчәйтү булырга мөмкин.
Әгәр дә сез үзегез кебек акыллы булсагыз, сез, әлбәттә, уйланырсыз: Логик яктан әйтсәк, PCR реакциясе бик конкрет булса, пример концентрациясе минималь таләптән артса, югары һәм түбән нокталар флюоресцент буяулар һәм dNTP кебек тәэсир итмәскә тиеш.Чыннан да, анналь температура дөрес оптимизацияләнгәндә, пример концентрациясенең Ct кыйммәтенә тәэсире табигый рәвештә минимумга төшәчәк.

Аннальинг температурасы дөрес оптимальләштерелгән, һәм пример концентрациясенең КТга тәэсире минимальләштереләчәк
Икенчел структура көчәйтү эффективлыгына тәэсир итә
Проблеманы күрсәтү өчен био-радтан рәсем алыйк.Ул шулай ук ​​икенчел структурасы булган генны көчәйтү өчен температура градиентын эшләп чыгара.

Икенчел структура барлыкка килә
Күрергә була, температура градиенты кимегәндә продуктлар пәйда була башлый һәм Ct кыйммәте алга бара, минималь кыйммәткә 60,7 ° C җитә, аннары температура градиенты кимегәндә Ct кыйммәте зурлана.Киресенчә, температура арта барган саен, икенчел структура ачыла һәм көчәйтү эффективлыгы арта.Билгеле температурага җиткәч, температураны арттыру көчәйтү эффективлыгын яхшырта алмый.Чөнки праймерларны бу вакытта тотрыклы берләштереп булмый.Шуңа күрәиң түбән Ct бәясе белән температураны эзләгез, икенчел структура шаблонын көчәйтү өчен иң яхшы температура!Әлбәттә, акыллы ахмаклар шуны белергә тиеш: кирәк булмаса, праймерларны үзгәртү һәм икенчел структура өлкәсеннән саклану яхшырак.
5. Куллану дәрәҗәсе
MIQE - Мәгълүмат анализы

Мәгълүмат анализы, нигездә, флуоресцент санлы PCR коралы белән бирелә.Узган мәкаләдә эксперимент дизайнында аңлатылган буш контроль кебек күп мәгълүмат анализлау эше эшләнде.Эчке белешмә геннар, кабатланган саннар һ.б. ачыкланды., монда без нигездә qPCR куллануны аңлатабыз.
qPCR киң кулланыла, һәм эксперименталь тикшерү һәм нуклеин кислотасы диагнозы иң еш кулланыла торган сценарийлар.
абсолют санлаштыру
Бүрәнә (башлангыч концентрация) цикл саны белән сызыклы бәйләнештә.Стандарт сызык билгеле стандарт күчермә номеры булган стандарттан ясалырга мөмкин, ягъни көчәйтү реакциясенең сызыклы бәйләнешен алырга мөмкин.Ampleрнәкнең Ct бәясе буенча, үрнәктә концентрация исәпләнә ала.Керергә шаблоннар күләме.

Абсолют санлы исәпләү ысулы
Абсолют санлаштыру стандарт сызыкка нигезләнергә тиеш.Стандарт сызык ясау өчен, стандарт кирәк.Гадәттә, стандарт - максатлы генны клонлау ярдәмендә алынган плазмид.Ни өчен ул плазмид?Чөнки түгәрәк плазмид ДНК иң тотрыклы.Стандарт продуктны 5-6 градиентта икеләтә катнашу (10 тапкыр эретү) буенча эретегез, эреткәндә бердәмлеккә игътибар итегез.Ct бәясе 15-30 арасында төшсен.

Стандарт әзерлек
Шул ук вакытта, сыналачак үрнәк шулай ук ​​эретелергә тиеш (эретү факторын исегездә тотыгыз), һәм Ct бәясе дә 15-30 арасында булырга тиеш.Стандарт продукт + сыналачак үрнәк машинага бергә куела.Йөгергәннән соң, стандарт матдә белән стандарт сызык ясалды, һәм концентрацияне исәпләү өчен, сынау өчен үрнәкләр стандарт сызыкка китерелде.
Гепатит В вирусы HBV күләме - гадәти абсолют санлаштыру, ул вирус копия санын 1мл канда саный ала.
Күчермә номерын исәпләү
Тикшерелергә тиешле үрнәк концентрациясе (ng / ul) = OD260 × 50ug / мл × эретү факторы
Молекуляр авырлык үрнәге = нигез саны × 324
Сынап карала торган үрнәкнең күчермә саны (күчермәләр / ул) = сыналачак үрнәкнең концентрациясе / үрнәкнең молекуляр авырлыгы × 6 × 1014

Күчермә номерын исәпләү ысулы

Aboveгарыда санны билгеләү өчен исәпләү ысулы.Бу математик проблема, аны урта мәктәпне тәмамлагач чишеп була, һәм математик проблемаларны гадәттә компьютерлар чишә.Аңламасагыз, аралашырга килә аласыз.
чагыштырма күләм
Нисби санлаштыру нигездә фәнни тикшеренүләрдә кулланыла.1мл канда ничә вирус бар, һәм ул ДНК вирусы, бу чагыштырмача детерминистик вакыйга: кан күләмен билгеләргә була, һәм ДНК вирусы чагыштырмача тотрыклы.Ләкин, безгә яфрактагы билгеле бер генның транскрипция копияләрен чагыштыру кыен, чөнки яфракның зурлыгын, авырлыгын, назлы булуын ачыклау авыр, алынган РНК күләмен билгеләү кыен, һәм кире транскрипциянең эффективлыгын билгеләү дә кыен, ягъни теләсә нинди адым эксперименталь мәгълүматларның хаталары булырга мөмкин һәм кулланылмый.
Шуңа күрә чагыштырмача санлаштыру элемент кертергә тиеш:эчке белешмә ген.
Башка сүзләр белән әйткәндә, чагыштырмача санлаштыру максатчан ген белән эчке белешмә ген арасында чагыштыру.Бер үк тукыма һәм бер үк күзәнәк белән чагыштырганда, үрнәк күләменең йогынтысы, РНК чыгару күләме, кире транскрипция эффективлыгы һәм PCR эффективлыгы чагыштырмача кечкенә.Кечкенә үрнәк күләме аркасында эчке белешмә геннар да, максатлы геннар да чагыштырмача кимеде.Шуңа күрә без моңа кадәр бердәмлеккә һәм тотрыклылыкка басым ясый идек.
Эчке белешмә геннар гадәттәхуҗалык геннары(өй саклаучы геннар), алар барлык күзәнәкләрдә тотрыклы чагылдырылган геннар классына карыйлар, һәм аларның продуктлары күзәнәкләрнең төп тормыш эшчәнлеген саклап калу өчен кирәк.
Бу төшенчәне бутамагыз.Өйдә эшләү геннары - биологик функция терминнары, ә эчке белешмә геннар - эксперименталь техник терминнар.Йорт саклаучы геннар эчке белешмә геннар итеп сайланганчы тикшерүне узарга тиеш.
Мисал өчен, без төрле тукымалар күзәнәкләрендә аларның экспрессив дәрәҗәләрен сынап карау өчен, астагы рәсемдә берничә хуҗалык генын сайлап алдык, һәм β-2-микроглобулинның экспрессив дәрәҗәләренең калган өч генныкыннан бөтенләй аерылып торганын ачыкладык, шуңа күрә алар эчке белешмә ген буларак кулланылмый.

Эчке белешмә генның коррекция функциясен аңлагач, эчке белешмә ген кертү аркасында ике алгоритм барлыкка килә.
· Ике стандарт сызык ысулы
· 2 - t Ct ысулы (КТ бәясен чагыштыру ысулы)
Әгәр дә сез төрләрне һәм ген функцияләрен өйрәнергә телисез икән, зинһар, алгоритм буенча тикшеренүләрдән баш тартыгыз һәм формулаларны турыдан-туры кулланыгыз, яки машиналарны турыдан-туры кулланыгыз.математика һәм инженерия буенча туры егет булсагыз, зинһар өчен иркен хис итегез.
икеләтә стандарт сызык ысулы
Контроль үрнәкнең максатлы генын һәм хуҗалык итү генын һәм стандарт сызык аша сынап карала торган үрнәкне санлагыз, аннары чагыштырма бәяне исәпләү формуласы буенча чагыштырма бәяне санагыз.
Уңай яклары: гади анализ, чагыштырмача гади эксперименталь оптимизация
Кимчелек: һәр ген өчен, экспериментларның һәр туры стандарт сызык ясарга тиеш
Куллану: Ген экспрессиясен көйләүдә иң еш кулланыла торган һәм танылган чагыштырма санлы ысулларның берсе
Формула түбәндәгечә:

Мисаллар түбәндәгечә:

Сан нәтиҗәләренә карап чагыштырма күләмне исәпләгез
2 - t Ct ысулы (КТ бәясен чагыштыру ысулы)

Уңай яклары: Стандарт сызык ясарга кирәкми
Кимчелекләр: көчәйтү эффективлыгы 100% ка якын дип уйланыла;стандарт тайпылыш <5%, һәм стандарт сызык һәм һәр көчәйтү арасындагы эффективлык эзлекле дип санала;эксперимент шартларын оптимизацияләү катлаулырак.
Куллану: Ген экспрессиясен көйләүдә иң еш кулланыла торган һәм танылган чагыштырма санлы ысулларның берсе

Әлбәттә, көчәйтү эффективлыгы гадәттә камил булу мөмкин түгел 1. Төзәтү ысулы: Әгәр без максатлы ген белән белешмә генның көчәйтү эффективлыгы бер үк икәнлеген белсәк, көчәйтү эффективлыгы 1гә тигез түгел икән, димәк, 2－ t Ct шулай итеп төзәтелергә мөмкин:
Әлегә флюоресцент санлы PCR турындагы эчтәлек бетте.