Пипетта киңәшләрен һәм EP трубаларын стерилизацияләү һ.б.
1. Деонизацияләнгән су белән 0,1% (меңнән бер) DEPC (бик агулы матдә) әзерләгез, аны ягулык капкасында игътибар белән кулланыгыз һәм яктылыктан 4 ° C ераклыкта саклагыз;
DEPC суы - DEPC белән эшкәртелгән һәм югары температура һәм югары басым белән стерилизацияләнгән чиста су.RNase, DNase һәм протеиназсыз булу өчен сынадылар.
2. Пипетка очын һәм EP трубасын 0,1% DEPC итеп куегыз, һәм пипетка очын һәм EP трубасын 0,1% DEP белән тутырыгыз.
3. Яктылыктан саклагыз, торыгыз, төнлә (12-24с)
4. Оч һәм EP трубасы булган тартманы DEPC белән сугарырга кирәкми.Очкычта яки EP трубасында DEPC суын тупас чыгарганнан соң, аны тутырыгыз һәм төрегез.
5. 121 градус, 30мин
6. 180 градус, берничә сәгать коры (ким дигәндә 3 сәгать)
Искәрмә: а.DEPC белән эшләгәндә латекс перчаткалар һәм битлекләр киегез!б, яисә DEPC стерилизациясез, 130 ℃, 90мин автоклав (күп лабораторияләр югары температураны ике тапкыр стерилизацияләү)
РНК алу турында уйлау
Тукыманың РНК изоляциясенең ике төп күренеше
РНК деградациясе һәм тукымалардагы пычрак калдыклары,деградациягә килгәндә, әйдәгез башта культуралы күзәнәкләрдән алынган РНКның җиңел деградацияләнмәвен карыйк.Хәзерге РНК чыгару реагентларында барысы да RNase-ны тиз тыя торган компонентлар бар.Лизатны культуралы күзәнәкләргә өстәгез, һәм аны гади генә кушыгыз, барлык күзәнәкләр лизат белән яхшылап кушылырга мөмкин, һәм күзәнәкләр тулысынча лизизацияләнә.Күзәнәкләр лизланганнан соң, лизаттагы актив ингредиентлар шунда ук күзәнәкләр эчендәге RNase-ны тоткарлый, шуңа күрә РНК сакланып кала.Ягъни, культуралы күзәнәкләр лизат белән җиңел һәм тулы бәйләнештә булганга, аларның РНКлары җиңел бозылмый;икенче яктан, тукымалардагы РНК җиңел деградацияләнә, чөнки тукымалардагы күзәнәкләр тиз арада лизат белән элемтәгә керү җиңел түгел.җитәрлек контакт аркасында.Шулай итеп, шулайРНК эшчәнлеген тоткарлаганда тукыманы бер күзәнәккә әйләндерү ысулы бар дип уйлап, деградация проблемасы тулысынча чишелергә мөмкин иде.
Сыек азот тегермәне мондый ысулның иң эффективы.Ләкин, сыек азотны тегермәнләү ысулы бик авыр, аеруча үрнәкләр саны күп булганда.Бу чираттагы иң яхшы әйберне тудырды: гомогенизатор..Әр сүзнеңгомогенизаторметод күзәнәкләр лизат белән бәйләнгәнче, RNase эшчәнлеге ничек тыела дигән сорауны карамый, киресенчә, тукымаларның өзелү тизлеге күзәнәкләр эчендәге RNase RN дәрәҗәсен киметкән тизлектән тизрәк дога кыла.
Электр гомогенизаторының эффекты яхшырак,һәм пыяла гомогенизаторның эффекты начар, ләкин, гомогенизатор ысулы деградация күренешен булдыра алмый.Шуңа күрә, чыгару бозылса, оригиналь электр гомогенизаторы сыек азот белән тарту өчен кулланылырга тиеш;оригиналь пыяла гомогенизатор электр гомогенизаторына үзгәртелергә яки турыдан-туры сыек азот белән тегермәнләнергә тиеш.Проблема 100% диярлек мөмкин.чишү.
Киләсе экспериментларга тәэсир иткән пычраклык калдыклары проблемасы деградациягә караганда күп төрле, һәм чишелешләр төрлечә.Ахырда,тукымада деградация яки калдык пычраклары булса, махсус эксперименталь материал өчен чыгару ысулы / реагент оптимальләштерелергә тиеш.Сез оптимизация өчен кыйммәтле үрнәкләрегезне кулланырга тиеш түгел: сез базардан балык / тавык кебек кечкенә хайваннарны сатып ала аласыз, РНК алу өчен материалның тиешле өлешен ала аласыз, калган өлешен белок алу өчен - авыз, ашказаны һәм эчәк белән тарту.
Алынган РНКның максатчан РНКсы төрле экспериментлар өчен кулланыла, һәм аның сыйфат таләпләре төрле
cDNA китапханә төзелеше фермент реакция ингибиторлары калдыксыз РНК бөтенлеген таләп итә.Төньяк югары РНК бөтенлеген һәм фермент реакция ингибиторы калдыкларына түбән таләпләрне таләп итә.RT-PCR артык югары РНК бөтенлеген таләп итми,ләкин фермент реакцияләрен тоткарлый.Калдык таләпләре катгый.Керү нәтиҗәне билгели;максат һәрвакыт иң югары чисталык РНК алу, ул кешеләргә һәм акчага төшәчәк.
Samрнәкләрне җыю / саклау
Деградациягә тәэсир итүче факторлар ampleрнәк тере тәнне / яки оригиналь үсеш мохитен калдырганнан соң, үрнәктәге эндоген ферментлар РНКны киметә башлыйлар,һәм деградация дәрәҗәсе эндоген ферментлар һәм температура белән бәйле.Традицион рәвештә, эндоген фермент эшчәнлеген тулысынча тыюның ике ысулы гына бар: шунда ук лизат өстәргә һәм яхшы һәм тиз гомогенизацияләү;вак кисәкләргә бүлеп, сыек азотта шунда ук туңдырыгыз.Ике алым да тиз эшләүне таләп итә.Соңгысы барлык үрнәкләр өчен дә яраклы, ә элеккеге күзәнәкләр һәм эндоген ферментлары аз булган һәм гомогенизацияләү җиңел булган тукымалар өчен яраклы.Аерым алганда, үсемлек тукымасы, бавыр, тимус, ашказаны асты бизе, флот, ми, май, мускул тукымасы һ.б. сыек азот белән иң яхшы туңдырылган.
Samрнәкләрнең фрагментлашуы һәм гомогенизациясе
Деградациягә һәм уңышка тәэсир итүче факторлартулы гомогенизация өчен, РНКны тулысынча һәм тулысынча чыгару өчен.Күзәнәкләр өзелмичә турыдан-туры гомогенизацияләнергә мөмкин.Кисемнәр өзелгәннән соң гына гомогенизацияләнергә мөмкин.Чүпрә һәм бактерияләр бертөрле булганчы тиешле ферментлар белән өзелергә тиеш.Түбән эндоген ферментлы тукымалар һәм гомогенизация җиңелрәк булган тукымалар лизатада берьюлы гомогенизатор белән изелергә һәм гомогенизацияләнергә мөмкин;үсемлек тукымасы, бавыр, тимус, ашказаны асты бизе, флот, баш мие, май, мускул тукымасы һәм башка үрнәкләр, Алар эндоген ферментларда бик югары яки җиңел бертөрле түгел,шуңа күрә тукымаларның өзелүе һәм гомогенизация аерым башкарылырга тиеш.Фрагментлашуның иң ышанычлы һәм иң нәтиҗәле ысулы - сыек азот белән тегермән, һәм гомогенизациянең иң ышанычлы ысулы - электр гомогенизаторын куллану.Сыек азот белән тегермән турында махсус искәрмә: бөтен тегермән процессында үрнәк эретелергә тиеш түгел, чөнки туңганда эндоген ферментлар күбрәк эшләргә мөмкин.
Лизат сайлау
Эшләү уңайлыгына һәм калдык эндоген пычрак факторларына тәэсир итү Гадәттә кулланыла торган лизис эремәләре RNase эшчәнлеген тоткарлый диярлек.Шуңа күрә, лизис чишелешен сайлауның төп ноктасы - чистарту ысулы белән берлектә карарга.Бер искәрмә бар:югары эндоген ферментлары булган үрнәкләрдә эндоген ферментларны активлаштыру сәләтен арттыру өчен фенол булган лизат кулланырга киңәш ителә.
Чистарту ысулын сайлау
Калдык эндоген пычракларга тәэсир итүче факторлар, чыгару тизлеге Күзәнәкләр кебек чиста үрнәкләр өчен, чистарту ысулы белән канәгатьләнерлек нәтиҗәләргә ирешергә мөмкин.Ләкин башка бик күп үрнәкләр өчен, аеруча үсемлекләр, бавыр, бактерияләр һ.б. кебек пычраклыклары булган кешеләр өчен чистарту ысулын сайлау бик мөһим.Колоннаны центрифугаль чистарту ысулы тиз чыгару тизлегенә ия һәм РНКның энзиматик реакциясенә тәэсир иткән пычракларны эффектив рәвештә бетерә ала, ләкин ул кыйммәт (Foregene чыгымлы эффектив комплектлар тәкъдим итә ала, тулырак мәгълүмат басыгызМонда);LiCl явым-төшеме кебек экономик һәм классик чистарту ысулларын куллану да канәгатьләнерлек нәтиҗәләргә ирешә ала, ләкин эш вакыты озын..
РНК алу өчен "Өч дисциплиналар һәм сигез караш"
Тәртип 1:Экзоген ферментларның пычрануын бетерегез.
Искәрмә 1:Каты битлекләр һәм перчаткалар киегез.
Искәрмә 2:Theентрифуга трубалары, киңәш башлары, пипетка чыбыклары, электрофорез танклары, һәм экспериментта катнашкан эксперименталь эскәмияләр яхшылап ташланырга тиеш.
Искәрмә 3:Экспериментта катнашкан реагентлар / чишелешләр, аеруча су, RNaseсыз булырга тиеш.
Тәртип 2:Эндоген ферментларның эшчәнлеген блоклагыз
Искәрмә 4:Тиешле гомогенизация ысулын сайлагыз.
Искәрмә 5:Тиешле лизатаны сайлагыз.
Искәрмә 6:Ampleрнәкнең башлангыч күләмен контрольдә тоту.
Тәртип 3:Чыгару максатын ачыклагыз
Искәрмә 7:Anyәрбер лизат системасы үрнәкнең максималь күләменә якынлашканда, чыгару уңышлары кискен төшә.
Искәрмә 8:Уңышлы РНК алу өчен бердәнбер икътисади критерий - уңыш түгел, алдагы экспериментларда уңыш.
RNase пычрануның иң яхшы 10 чыганагы
1. Бармаклар - экзоген ферментларның беренче чыганагы, шуңа күрә перчаткалар кияргә һәм еш алыштырырга кирәк.Моннан тыш, битлекләр дә кияргә тиеш, чөнки сулыш алу да ферментларның мөһим чыганагы.Перчатка битлегенең өстәмә өстенлеге - экспериментны саклау.
2. Пипетта киңәшләре, центрифуга торбалары, пипеталар - RNase стерилизация белән генә инактивлаштырыла алмый, шуңа күрә пипетка киңәшләре һәм центрифуга торбалары DEPC белән эшкәртелергә тиеш, хәтта алар DEPC белән эшләнгән булса да.Махсус максатлы пипетка куллану яхшырак, аны кулланганчы, 75% спиртлы мамык шары белән сөртегез;өстәвенә, башны бетерүче кулланмагыз.
3. Су / буфер RNase пычрануыннан азат булырга тиеш.
4. Ким дигәндә, сынау таблицасын 75% спиртлы мамык шарлары белән чистартырга кирәк.
5.Эндоген RNase Барлык тукымаларда да эндоген ферментлар бар, шуңа күрә тукымаларны сыек азот белән тиз туңдыру - деградацияне киметүнең иң яхшы ысулы.Сыек азотны саклау / тарту ысулы чыннан да уңайсыз, ләкин ул югары дәрәҗәдәге эндоген ферментлары булган тукымалар өчен бердәнбер ысул.
6. РНК үрнәкләре РНК чыгару продуктларында RNase пычрану эзләре булырга мөмкин.
7. Плазмидны чыгару Плазмидны чыгару РНКны еш куллану өчен Rnase куллана, һәм Rnase калдыклары Протеиназ К белән үзләштерелергә һәм PCI тарафыннан чыгарылырга тиеш.
8. РНК саклау түбән температурада сакланса да, RNase күләменең күләме РНКның бозылуына китерәчәк.РНКны озак вакыт саклау өчен иң яхшы чишелеш - тоз / спиртлы асылмалау, чөнки алкоголь түбән температурада барлык фермент активлыгын тоткарлый.
9. Кионнарда (Ca, Mg) бу ионнар булганда, 80Ста 5 минут җылыту РНКның ярылуына китерәчәк, шуңа күрә РНКны җылытырга кирәк булса, саклау чишелешендә эретүче агент булырга тиеш (1мМ Натрий Ситрат, pH 6.4).
10. Киләсе экспериментларда кулланылган ферментлар RNase белән пычранырга мөмкин.
РНК алу өчен 10 киңәш
1: RNase эшчәнлеген тиз булдырмагыз.Collectionыюдан соң үрнәкләр тиз туңдырыла, һәм RNase лизис вакытында тиз эшләү белән активсыз.
2: ribгары рибозимлы тукымалар өчен тиешле чыгару ысулын сайлагыз, һәм фенол булган ысулны куллану иң яхшысы.
3: Фаразлау сыйфаты Төньяк, CDNA китапханә төзелеше югары сафлык таләп итә, һәм RT-PCR һәм RPA (Ribonuclease саклау анализы) югары сафлык таләп итми.RT-PCR югары чисталык таләп итә (фермент ингибиторы калдыклары).
4: Гомогенизация - уңышны яхшырту һәм деградацияне киметү өчен ачкыч.
5: РНК электрофорезын ачыклауның бөтенлеген тикшерегез, 28S: 18S = 2: 1 - тулы билге, 1: 1 шулай ук күпчелек экспериментлар өчен яраклы.
6: RT-PCR өчен ДНКны бетерү, массив анализы ДНКны бетерү өчен I Dnase куллану яхшырак.
7: Экзоген ферментларның пычрануын киметү - ферментларны читтән алып булмый.
8: Аз концентрацияле нуклеин кислотасын туплаганда, явым-төшем реагенты кушылырга тиеш.Ләкин ферментлар һәм ДНК пычрануы булган ко-явым-төшемнәрне булдырмас өчен.
9: РНКны яхшылап эретегез, кирәк булса, 65Ста 5 минут җылытырга.
тиешле саклау ысулы
Аны –20C кыска вакытка, һәм –80C озак сакларга мөмкин.РНК уңышын яхшырту өчен беренче адым - төрле үрнәкләрнең РНК эчтәлеге төрлечә булуын аңлау.Бөер, ашказаны асты бизе, йөрәк, уртача муллык (0.05-2уг / мг) кебек ми, яралгы, бөер, үпкә, тимус, аналык, аз муллык (<0.05уг / мг) кебек бөер, сөяк, май кебек югары муллык (2-4уг / мг).
1: RN чыгару өчен Lyse күзәнәкләре - РНК чыгарылмаса, уңыш кимиячәк.Электр гомогенизациясе башка гомогенизация ысулларына караганда яхшырак эшли, ләкин шулай ук сыек азотны эретү, энзиматик ашкайнату кебек башка ысуллар белән кушылырга кирәк булырга мөмкин (Лизозим / Литиказ)
2: чыгару ысулын оптимизацияләү.Фенолга нигезләнгән ысуллар белән иң зур проблемалар - тулы булмаган стратификация һәм өлешчә РНК югалту (супернатантны тулысынча бетереп булмый).Тәмамланмаган стратификация югары нуклеин кислотасы һәм протеин күләме белән бәйле, алар кулланылган лизат күләмен арттыру яки үрнәк күләмен киметү белән чишелә ала.Адипоз тукымасына хлороформ чыгару ады өстәлде.РНК югалту арткы насос ярдәмендә яки центрифугациядән соң органик катламны чыгарып киметелергә мөмкин.Колоннаның центрифугация ысуллары белән иң зур проблема - артык үрнәк.
Классик чыгару киңәшләре
1. Фенолны чистарту: 1: 1 тигез күләмдә Фенол / Хлороформ кушыгыз һәм 1-2 минутка көчле кушыгыз.2 минут югары тизлектә центрифуга.Супернантны игътибар белән бетерегез (80-90%).Беркайчан да урта катламга кермәгез.Фенол / Хлороформага реакция эремәсенең тигез күләме кушылырга һәм супернатант алынырга мөмкин.Ике супернантны уңышны яхшырту өчен нуклеин кислотасы явым-төшеме өчен бергә кушып була.Аралашканда артык йомшак булмагыз, һәм барлык супернантны бетерергә тырышмагыз.
2. 70-80% этанол белән юу: юу вакытында нуклеин кислотасы калдык тозның юылуы өчен туктатылырга тиеш.Шул ук вакытта, этанолны түккәннән соң, центрифуга югары тизлектә берничә секундка, аннары калдыклы этанолны торба белән алып ташлагыз.Бүлмә температурасында 5-10 минут торгач эрегез.
11. Махсус оешмаларны чыгару
1. ibепсел тукымасы: йөрәк / скелет мускуллары кебек җепле тукымалардан РНК алу ачкычы - тукыманы тулысынча бозу.Бу тукымаларның күзәнәк тыгызлыгы түбән, шуңа күрә тукыманың берәмлек авырлыгына РНК күләме аз, һәм мөмкин кадәр башлангыч күләмне куллану яхшырак.Туңдыру шартларында тукыманы яхшылап тартырга онытмагыз.
2. proteinгары протеин / майлы тукымалар: ми / үсемлек мае күп.PCI чыгарганнан соң, супернатантта ак флокулалар бар.Супернатант хлороформа белән яңадан чыгарылырга тиеш.
3. Nucгары нуклеин кислотасы / рибозим эчтәлеге булган тукымалар: флот / тимус югары нуклеин кислотасы һәм рибозимга ия.Туңдыру шартларында тукымаларны тарту, аннары тиз гомогенизация рибозимнарны эффектив рәвештә активлаштырырга мөмкин.Ләкин, лизат бик ябыштыргыч булса (югары нуклеин кислотасы булганга), PCI чыгару эффектив катламга керә алмый;күбрәк лизат өстәү бу проблеманы чишә ала.Берничә PCI чыгару күбрәк ДНКны бетерә ала.Әгәр дә алкоголь кушылганнан соң ак явым-төшем барлыкка килсә, бу ДНКның пычрануын күрсәтә.Кислоталы PCI белән яңадан чыгару ДНК пычрануын бетерә ала.
4. antсемлек тукымасы: plantсемлек тукымасы хайван тукымасына караганда катлаулырак.Гадәттә, үсемлекләр сыек азот шартларында җир, шуңа күрә эндоген ферментлар белән РНКның бозылуы сирәк очрый.Әгәр деградация проблемасы чишелмәсә, ул, әлбәттә, үрнәктәге пычраклыклар аркасында килеп чыга.Күпчелек үсемлекләрдә булган пычраклар калдыкларга китерәчәк, һәм калдыкларның сәбәбе еш кына бу пычракларның РНК белән охшашлыгы булганга: сез явым-төшем ясыйсыз, ә сез adsorb һәм I adsorb.Бу характеристикалар аларның бик көчле фермент ингибиторы булуын билгели.
Хәзерге вакытта коммерция РНК чыгару реагентлары барлык хайваннар тукымаларына диярлек кечкенә көйләнмәләр белән җайлаштырыла ала, ләкин күпчелек үсемлек тукымалары өчен яраклы коммерция РНК чыгару реагентлары аз.Бәхеткә, Foregene махсус тәэмин итә алаүсемлек РНК чыгару комплектлары, бездә барTotalсемлекнең гомуми РНК изоляциясе комплекты, Totalсемлекнең гомуми RNA изоляциясе комплекты.Соңгысы югары полисахарид һәм полифенол булган үсемлекләр өчен махсус эшләнгән.РНК алу өчен лаборатория кулланучыларының фикерләре аеруча яхшы.
12. ampleрнәк туңдыру һәм эретү эффекты Туңдырылган үрнәк зуррак булырга мөмкин, һәм аны РНК алу өчен кулланганчы кисәргә кирәк.Кисү вакытында үрнәкләр эри (гадәттә өлешчә).Туңдырылган үрнәкләрне РНК чыгарганчы үлчәргә кирәк булырга мөмкин, һәм эретү, әлбәттә, бу процесс вакытында булачак.Кайвакыт, үрнәкне эретү сыек азот тегермәне вакытында да була;яки туңдырылган үрнәк лизатка сыек азот тегермәненнән турыдан-туры кушыла, һәм эретү тулысынча гомогенизация алдыннан булачак.Тикшеренүләр күрсәткәнчә, туңдырылган тукымалар эретү вакытында РНК деградациясенә күбрәк ия.Мөгаен, сәбәп: туңдыру процессы күзәнәк эчендәге структураларны боза, эндоген ферментларның РНК белән туры элемтәгә керүен җиңеләйтә.
13. РНК сыйфатын бәяләү Гадәттә, электрофорез РНКның бөтенлеген бәяләү өчен кулланыла, һәм РНК чисталыгын бәяләү өчен A260 / A280 кулланыла.Теория буенча, тулы РНКның 28S: 18S = 2.7: 1 нисбәте бар, һәм күпчелек мәгълүмат 28S: 18S = 2: 1 нисбәтенә басым ясый.Факт шуны күрсәтә: күзәнәкләрдән башка үрнәкләрдән алынган РНКның берсе дә 2: 1 нисбәтендә түгел (бу Agilent Bioanalyzer ярдәмендә алынган).
РНКның электрофорез нәтиҗәләре күп факторларга тәэсир итә, шул исәптән икенчел структура, электрофорез шартлары, үрнәк йөкләү, EB туендыру дәрәҗәсе һ.б. РНКны табу һәм контроль буларак DNA Marker куллану өчен туган электрофорез кулланыгыз.Әгәр 28С 2кбда һәм 18С 0,9 кбда ачык булса, һәм 28S: 18S> 1 булса, бөтенлек соңгы экспериментлар таләпләренә җавап бирә ала.
A260 / A280 - буталчыклык тудырган күрсәткеч.Беренчедән, нуклеин кислоталары өчен бу күрсәткечнең оригиналь мәгънәсен ачыкларга кирәк: саф РНК, аның A260 / 280 = якынча 2,0.Чиста РНК - "сәбәп" һәм A260 / A280 = 2 - "эффект".Хәзер һәркем A260 / A280ны "сәбәп" итеп куллана, "әгәр A260 / A280 = 2 икән, РНК чиста", бу табигый рәвештә буталчыкка китерә.
Әгәр дә сез кызыксынсагыз, сез РНК үрнәгенә фенол, гуанидин изотиокянаты, PEG һ.б. чыгаруда еш кулланыла торган бераз реагент өсти аласыз, аннары A260 / A280 нисбәтен үлчәгез.Чынбарлык шунда: РНК алу өчен кулланылган реагентларның күбесе, шулай ук үрнәктәге күп пычраклар, A260 һәм A280 тирәләрен үзләштерәләр, A260 / A280 тәэсиренә.
Хәзерге вакытта иң гыйбрәтле ысул - 200-300 нм диапазонында РНК үрнәкләрен сканерлау.Чиста РНКның кәкресе түбәндәге үзенчәлекләргә ия: сызык шома, A230 һәм A260 - ике инфляция ноктасы, A300 0, A260 / A280 = якынча 2.0, һәм A260 / A230 = 2,0 тирәсе.Әгәр дә сканерлау мәгълүматлары булмаса, A260 / A230 нисбәте дә билгеле булырга тиеш, чөнки бу нисбәт энзиматик реакциягә тәэсир итүче барлык пычракларны йөртүгә сизгеррәк.Theайланманың сызыклы диапазонын исәпкә алыгыз (A260 өчен 0,1–0.5).
Тагын ике файдалы күренеш бар: суда A260 / A280 үлчәнгәндә катнашу якынча 0,3 түбән булачак;10 мм EDTA белән үлчәнгән катнашу 1 мм EDTA белән чагыштырганда якынча 0,2 югарырак.
Бәйләнешле продуктлар:
Китай Заводының гомуми RNA изоляциясе комплекты җитештерүче һәм тәэмин итүче |Foregene (foreivd.com)
РНК изоляциясе сериясе - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Пост вакыты: Июль-15-2022
