Билгеле булганча, үзәк догмада РНК - ДНК һәм протеин экспрессиясе арасындагы транскрипцияле арадашчы.ДНКны табу белән чагыштырганда, РНКны табу организмдагы ген экспрессиясен объектив чагылдыра ала.РНК катнашындагы тәҗрибәләргә түбәндәгеләр керә: qRT-PCR, RNA-Seq, һәм кушылу генын ачыклау һ.б.Чүп-чар, чүп-чар, РНКның сыйфаты яхшы булмаса, эксперимент нәтиҗәләре канәгатьләнерлек булмаска тиеш, төгәл булмаган мәгълүматлар яки начар кабатлану.Шуңа күрә, РНК эшкәртүгә күбрәк игътибар бирелергә тиеш, һәм киләсе эксперименталь мәгълүматларның төгәллеген һәм төгәллеген тәэмин итү өчен сыйфат белән идарә итү бәйләнеше дә мөһимрәк.

РНКның сыйфатын контрольдә тоту өчен, гадәттә, гадәттә кулланыла торган түбәндәге ысуллар бар:

• Спектропотометрия
• агароза гели электрофорезы
• Агилент биоанализер
• реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR
• Кубит флуоресцент буяу ысулы

01 Спектропотометрия

РНК икеләтә бәйләнешкә ия һәм 260nm дулкын озынлыгында үзләштерүнең иң югары ноктасына ия.Ламберт-Бирер законы буенча, без РНК концентрациясен 260нм га сеңдерүнең иң югары ноктасыннан саный алабыз.Моннан тыш, без РНКның чисталыгын 260нм, 280нм һәм 230нм сеңдерүнең иң югары ноктасы буенча исәпли алабыз.280нм һәм 230нм - протеиннарның һәм кечкенә молекулаларның үзләштерү чокы.Квалификацияле РНК чисталыгының A260 / A280 һәм A260 / A230 нисбәте 2-дән зуррак булырга тиеш. Әгәр дә ул 2-дән ким булса, бу РНК үрнәгендә аксым яки кечкенә молекулалар пычрануы бар һәм яңадан чистартылырга тиеш.Пычрату чыганаклары түбән агымдагы экспериментларга тәэсир итәчәк, мәсәлән, PCR реакцияләренең көчәйтү эффективлыгын тыю, санның төгәл булмаган нәтиҗәләре.РНКның чисталыгы алдагы нәтиҗәләргә зур йогынты ясый, шуңа күрә спектропотометрия, гадәттә, нуклеин кислотасы экспериментларының беренче адымында алыштыргысыз сыйфат контроле.

Рәсем 1. Типик РНК / ДНК абсорбция спектры

02 Агароза гели электрофорезы

Чисталыкка өстәп, РНКның бөтенлеге РНК сыйфатын бәяләү өчен мөһим күрсәткечләрнең берсе.РНКның деградациясе үрнәктә күп санлы кыска фрагментларга китерәчәк, шуңа күрә эффектив ачыклана һәм белешмә эзлеклелеге белән капланган РНК фрагментлары саны кимиячәк.РНК бөтенлеген 1% агароза гелендә гомуми РНКның электрофорезы белән тикшереп була.Бу ысул гельне үзегез конфигурацияли ала, яисә E-Gel ™ системасын бөтенлекне сынау өчен куллана ала.Гомуми РНКның 80% тан артыгы - рибосомаль РНК, аларның күпчелеге 28S һәм 18S rRNA (имезүчеләр системаларында).Яхшы сыйфатлы РНК ике ачык якты барны күрсәтәчәк, алар 28S һәм 18S якты барлар, тиешенчә, 5 Кб һәм 2 Кб, һәм катнашу 2: 1 гә якын булачак.Әгәр дә ул таралган хәлдә булса, бу РНК үрнәге бозылган булырга мөмкин, һәм соңрак тасвирланган ысулны РНК сыйфатын тикшерү өчен кулланырга киңәш ителә.

Рәсем 2. Агароза гели электрофорезында бозылган (2-нче юл) һәм тулы РНКны (3-нче юл) чагыштыру.

03 Агилент биоанализер

Aboveгарыда тасвирланган агароза гели электрофорез ысулына өстәп, безгә РНКның бөтенлеген ачыкларга булыша ала, без шулай ук ​​РНКның бөтенлеген билгеләү өчен Agilent биоанализаторын куллана алабыз.РНК концентрациясен һәм бөтенлеген бәяләү өчен ул микрофлюидика, капиллярлы электрофорез һәм флуоресцент комбинациясен куллана.Эчке алгоритм кулланып, РНК үрнәгенең профилен анализлау өчен, Агилент биоанализатор РНКның тулы кыйммәтен, РНК бөтенлеге номерын (алга таба RIN дип атала) исәпли ала [1].RIN кыйммәте никадәр зур булса, РНКның бөтенлеге шулкадәр югары (1 бик начарланган, 10 иң тулы).РНК катнашындагы кайбер экспериментлар RINны сыйфат бәяләү параметры итеп кулланырга тәкъдим итә.Мисал итеп, югары үткәргеч эзләү экспериментларын (алга таба NGS дип атыйлар), Термо Фишерның Онкомин панель сериясендә B күзәнәк һәм T күзәнәк антиген рецепторларын ачыклау өчен кулланыла торган Oncomine ™ кеше иммун репертуары күрсәтмәләре, RIN кыйммәтләре 4, зуррак эффектив уку һәм клоннарны үлчәп була (3 нче рәсем).Төрле панельләр өчен төрле тәкъдим ителгән диапазоннар бар, һәм еш кына югары RIN эффектив мәгълүмат китерә ала.

3 нче рәсем, Oncomine ™ кеше иммун репертуары экспериментларында, RIN 4тән зуррак булган үрнәкләр эффектив уку һәм T күзәнәк клоннарын ачыклый ала.【2】

Ләкин, RIN кыйммәтенең кайбер чикләүләре дә бар.RIN NGS эксперименталь мәгълүматларның сыйфаты белән югары бәйләнештә булса да, FFPE үрнәкләре өчен яраксыз.FFPE үрнәкләре озак вакыт химик эшкәртелде, һәм алынган РНК гадәттә чагыштырмача түбән RIN кыйммәтенә ия.Ләкин, бу экспериментның эффектив мәгълүматлары канәгатьләнерлек булырга тиеш дигән сүз түгел.FFPE үрнәкләренең сыйфатын төгәл бәяләү өчен безгә RINдан башка үлчәүләрне кулланырга кирәк.RIN-га өстәп, Agilent биоанализеры DV200 кыйммәтен РНК сыйфатын бәяләү параметры итеп саный ала.DV200 - РНК үрнәгендә 200 ат көченнән зуррак фрагментларның өлешен исәпләүче параметр.DV200 - RFPга караганда FFPE үрнәк сыйфатының яхшырак күрсәткече.FFPE тарафыннан алынган РНК өчен, аның эффектив табыла ала торган геннар саны һәм геннар төрлелеге белән бик югары бәйләнеше бар [3].DV200 FFPE сыйфатын ачыклаудагы җитешсезлекләрне каплый алса да, Agilent биоанализеры РНК үрнәкләрендә сыйфат проблемаларын тулысынча анализлый алмый, шул исәптән үрнәкләрдә ингибиторлар бармы.Ингибиторлар үзләре агымдагы экспериментларның көчәйтү эффективлыгына тәэсир итә һәм файдалы мәгълүматлар күләмен киметә ала.Ampleрнәктә ингибитор бармы-юкмы икәнен белү өчен, без киләсе вакытта тасвирланган реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR ысулын куллана алабыз.

04 реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR

Реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR ысулы үрнәк ингибиторларны гына түгел, FFPE үрнәгендә РНК сыйфатын да төгәл чагылдыра ала.Agilent биологик анализаторлары белән чагыштырганда, реаль вакыттагы флуоресцент санлы инструментлар киң куллану аркасында эре биологик лабораторияләрдә популяр.РНК үрнәкләренең сыйфатын сынап карау өчен, безгә GUSB (мәче. Hs00939627) кебек эчке белешмә геннар өчен праймериз зоналарын сатып алырга яки әзерләргә кирәк.Абсолют санлы экспериментлар үткәрү өчен бу праймериз, пробалар һәм стандартлар җыелмасын кулланып (билгеле концентрациянең гомуми РНКсы), эффектив РНК фрагмент концентрациясе РНК сыйфатын бәяләү стандарты (кыскача функциональ РНК саны).NGS тестында, без РНК үрнәкләренең FRQ эффектив мәгълүмат күләме белән бик югары корреляциягә ия булуын таптык.0,2ng / uL FRQ-тан зуррак барлык үрнәкләр өчен, ким дигәндә 70% укулар эзлеклелеген эффектив каплый ала (Рәсем 4).

Рәсем 4, флуоресцент сан ысулы белән ачыкланган FRQ кыйммәте NGS экспериментында алынган эффектив мәгълүматлар белән бик югары корреляциягә ия (R2> 0.9).Кызыл сызык - 0,2 ng / uL тигез булган FRQ кыйммәте (log10 = -0.7).【4】

FFPE үрнәкләренә куллану белән беррәттән, реаль вакытта санлы PCR ысулы да үрнәкләрдәге ингибиторларны эффектив күзәтә ала.Эчке позитив контроль (IPC) һәм аның анализы белән реакция системасына табылачак үрнәкне өсти алабыз, аннары Ct кыйммәтен алу өчен флуоресцент күләмен ясый алабыз.Әгәр дә Ct бәясе үрнәк булмаган реакциядә Ct кыйммәтеннән артта калса, бу ингибиторның үрнәктә булуын күрсәтә һәм реакциядә көчәйтү эффективлыгын тоткарлый.

05 Кубит флуоресцент буяу ысулы

Кубит Флюорометр - нуклеин кислотасы концентрациясе һәм чисталыкны ачыклау өчен иң еш кулланыла торган кечкенә җайланма, аны эшләү җиңел һәм һәр молекуляр биология лабораториясендә диярлек бар.Ул нуклеин кислотасының концентрациясен төгәл исәпли һәм нуклеин кислотасын бәйләүче флуоресцент буяуны (Кубитны ачыклау реагенты).Кубит югары сизгерлеккә һәм үзенчәлеккә ия, һәм РНКны pg / µL концентрациясенә кадәр төгәл саный ала.Нуклеин кислотасы концентрациясен төгәл саный белү белән беррәттән, Термо Фишерның соңгы яңа моделе Qubit 4.0 шулай ук ​​РНКның бөтенлеген ачыклый ала.Qubit 4.0′s RNA ачыклау системасы (RNA IQ Assay) бер үк вакытта ике махсус флуоресцент буяуны табып РНКның бөтенлеген ачыклый.Бу ике флюоресцент буяу, зур фрагментларга һәм РНКның кечкенә кисәкләренә бәйләнергә мөмкин.Бу ике флуоресцент буяу үрнәктә РНКның зур фрагментларының өлешен күрсәтә, һәм моннан РНК сыйфатын күрсәтүче IQ (Integrity and Quality) кыйммәте исәпләнә ала.IQ кыйммәте FFPE өчен дә, FFPE булмаган үрнәкләр өчен дә кулланыла, һәм киләсе эзлеклелек сыйфатына зур йогынты ясый.NGS экспериментларын мисал итеп алсак, Ion torrent ™ платформасында үткәрелгән RNA-Seq сынау экспериментларында IQ кыйммәтләре 4 дән артык булган үрнәкләрнең ким дигәндә 50% эффектив укулары булган (5 нче рәсем).Aboveгарыда күрсәтелгән ачыклау ысуллары белән чагыштырганда, Qubit IQ Assay эшләү өчен уңайлырак кына түгел, ә азрак вакыт ала (биш минут эчендә), шулай ук ​​үлчәнгән IQ бәясе параметры һәм агымдагы экспериментларның мәгълүмат сыйфаты арасында зур бәйләнеш бар.

Рәсем 5, Qubit RNA IQ кыйммәте белән RNA-Seq картасы укулары арасында зур бәйләнеш бар.【5】

Aboveгарыдагы кереш сүз аша мин ышанам, РНКның сыйфатын контрольдә тоту ысулларын һәркем аңлый.Практикада сез сайлый аласызүрнәк төре һәм булган кораллар буенча тиешле ысул.РНК сыйфатын контрольдә тотып кына, без начар үрнәк сыйфаты аркасында килеп чыккан экспериментларның уңышсызлыгыннан саклый алабыз, шулай итеп кыйммәтле вакытны, энергияне һәм бәяне саклый алабыз.

Белешмә продуктлар:

Хайваннарның гомуми РНК изоляциясе комплекты

Күзәнәкнең гомуми РНК изоляциясе комплекты

сылтамалар

【1】 Шрөдер, А., Мюллер, О, Стокер, С. һ.б.RIN: РНК үлчәүләренә бөтенлек кыйммәтләрен билгеләү өчен РНК бөтенлеге саны.BMC молекуляр биол 7, 3 (2006).https:// doi .org / 10.1186 / 1471-21 99-7-3

【2】 Онкомин кеше иммун репертуары куллану өчен кулланма (Пуб. MAN MAN0017438 Rev. C.0).

3https://doi.org/10.1093/toxsci/