RT-qPCR экспериментында РНК чыгару һәм сыйфат бәяләү, кире транскрипция һәм qPCR өч адым бар, һәр адымда бик күп саклык чаралары бар, без түбәндә җентекләп таныштырырбыз.

Ⅰ.РНК сыйфатын бәяләү

RT-qPCR экспериментында, РНК чыгару тәмамланганнан соң, РНК сыйфатын бәяләргә кирәк, һәм алга таба эксперимент квалификацияле булганнан соң гына үткәрелергә мөмкин.Бәяләү ысулларына спектропотометр, Агилент гель электрофорезы, Агилент 2100 анализы керә, алар арасында иң еш кулланыла торган спектропотометр һәм агароза гели электрофорез ысулы ачыклау.Әйтергә кирәк, РНК сыйфатын тәэмин итү өчен, РНК концентрациясен, чисталыгын һәм бөтенлеген ачыклау һәм анализлау өчен бу ике ысул бергә кулланылырга тиеш.

Бәйләнешле РНК изоляциясе комплекты: 

Күзәнәкнең гомуми РНК изоляциясе комплекты

Minгары чистартылган һәм югары сыйфатлы гомуми РНКны төрле культуралы күзәнәкләрдән 11 минутта алырга мөмкин.

Хайваннарның гомуми РНК изоляциясе комплекты

Төрле хайван тукымаларыннан югары чисталык һәм югары сыйфатлы гомуми РНКны тиз һәм эффектив рәвештә чыгарыгыз.

Спектропотометр:

Спектропотометр, нигездә, РНК концентрациясен һәм чисталыгын билгеләү өчен кулланыла, ләкин ул РНКның һәм геном калдыкларының бөтенлеген ачыклый алмый.Алар арасында, A260 / 280 һәм A260 / 230 - РНК чисталыгын ачыклау өчен мөһим параметрлар, һәм РНК чисталыгы аларның кыйммәтләренең үзгәрүенә карап ачыкланырга мөмкин:

1. 1.9 2.1, РНКның өлешчә деградациясен күрсәтә, моны агароза гели электрофорезы белән расларга мөмкин.

2. 2.0

Агароза гели электрофорезы:

Агароза гели электрофорез анализы РНК бөтенлеген, геном һәм протеин калдыкларын анализлый ала, ләкин РНК концентрациясен төгәл саный алмый яки органик реагент калдыкларын таба алмый.Мисал өчен эукариотик РНК шаблоннарын алыгыз:

1. РНК агароза гели электрофорезына дучар булды.Әгәр дә гель картасында 28sRNA, 18sRNA һәм 5.8sRNA өч бер төркем булса, бу алынган РНКның тотрыклы булуын күрсәтә.Әгәр дә тарту күренеше булса, бу РНКның өлешчә деградациясен күрсәтә.

2. Әгәр клей тишеге белән 28sRNA полосасы арасында бер якты полоса булса, геном ДНК калдыклары булырга мөмкин.

3. Әгәр клей тишегендә полосалар барлыкка килсә, бу протеин һәм башка макромолекуляр матдәләр калдыклары булырга мөмкинлеген күрсәтә.

Ⅱ. Кире транскрипция

РНК чыгару тәмамлангач, алдагы экспериментлар өчен аны CDNAга кире кайтарырга кирәк, шуңа күрә кире адым кирәк.Кире транскрипция кире транскриптаз һәм праймер сайлаудан кертеләчәк:

Кире транскриптаз сайлау:

Типик кире транскрипталарга AMV RTase һәм MMLV RTase керә.AMV RTase RNase H көчле активлыкка, кыска синтез озынлыгына, аз синтез күләменә һәм яхшы җылылык тотрыклылыгына ия (42 ~ 55 ℃).MMLV RTase-ның RNase H активлыгы зәгыйфь, синтез озынлыгы озын, синтез күләме зур, һәм җылылык тотрыклылыгы начар (37 ~ 42 ℃).

RNase H ферменты RNA шаблонын киметүче функциягә ия булганлыктан, кире транскрипция вакытында зәгыйфь RNase H активлыгы булган MMLV өстенлекле сайланырга тиеш, һәм соңрак генетик инженериядән соң MMLV җылылык тотрыклылыгы сыйфатлы сикерүгә иреште.Алдан алуФорази кире транскриптаз (кире транскрипция өчен M-MLV) Мисал буларак, ул генетик рекомбинация технологиясен кулланып, Э.Коли инженер бактерияләрендә күрсәтелгән яңа кире транскриптаз.Бу рекомбинант ДНК полимерасы, бер полосалы РНК, ДНК яки РНКдан тулы ДНК полосасын синтезлый: ДНК гибриды.Аның RNase H эшчәнлеге, көчле тотрыклылыгы, көчле РНК якынлыгы, югары ачыклау сизгерлеге юк.

 

Форази кире транскриптаз (кире транскрипция өчен M-MLV)

Праймер сайлау:

Гадәттә ТР праймериз өч категориягә бүленә: олиго dT, очраклы праймерлар һәм генга хас праймерлар.Төрле эксперимент таләпләре буенча куллану өчен яраклы праймерларны сайлагыз.

1. Әгәр шаблон эукариотик булса һәм соңрак CDNA PCR көчәйтү өчен кулланылса, Олиго (dT) тәкъдим ителә;Киләсе эксперимент qPCR өчен генә кулланылса, Олиго (dT) кире транскрипциянең эффективлыгын күтәрү өчен очраклы праймериз белән кушылырга киңәш ителә.

2. Әгәр шаблон прокариотлардан булса, кире транскрипция өчен очраклы праймерлар яки ген махсус праймериз сайланырга тиеш.

Ⅲ.qPCR

Флуоресцент санлаштыру, нигездә, санлы ысуллар, праймериз дизайн принциплары, ROX сайлау, реакция системасы конфигурациясе һәм реакция шартларын көйләүдән эшләнгән.

Санлы ысулларны сайлау:

Санлы ысуллар чагыштырма санлы методларга һәм абсолют сан ысулларына бүленә.Нисби санлаштыру кайбер дәвалау ысулларының ген экспрессиясенә тәэсирен ачыклау, төрле вакытта ген экспрессиясен ачыклау һәм төрле тукымалардагы ген экспрессиясен чагыштыру өчен кулланылырга мөмкин.Абсолют санлаштыру вирустагы нуклеин кислотасы күләмен ачыклый ала һ.б.Экспериментлар ясаганда, без үз тәҗрибәләребез буенча тиешле санлы ысулларны сайларга тиеш.

Төп проектлау принциплары:

QPCR өчен праймериз дизайны көчәйтү эффективлыгы һәм продукт үзенчәлеге белән турыдан-туры бәйле.Шуңа күрә, яхшы праймерларны дөрес проектлау - уңышлы qPCRның беренче адымы.Праймер дизайнында гадәти пример дизайны принцибына туры килгәндә түбәндәге принципларга игътибар итергә кирәк:

1. Максатлы фрагментның озынлыгы 100 дән 300 ат көченә кадәр контрольдә тотыла;

2. Геном ДНК тәэсиреннән саклану өчен кросс-экзон дизайны;

3. Дизайнланган праймериз көчәйтү эффективлыгы өчен сыналырга тиеш, һәм көчәйтү эффективлыгы стандартка җиткәч кенә (90-110%) санлы экспериментлар өчен кулланыла ала;

4. Пример концентрациясе гадәттә 0,1М белән 1,0уМ арасында оптимальләштерелә.

СайлауROX:

Санлы реакция процессында ROX оптик юл аермасын, пипетинг хата яки парга әйләнү һәм конденсация аркасында килеп чыккан күләм аермасын көйли ала, нәтиҗәләрнең кабатлануын яхшырта.Ләкин, ROX сайлау корал белән бәйле булуын әйтергә кирәк.QPCR инструменты тишекләр арасындагы аерманы автоматик рәвештә төзәтү функциясенә ия булса, ROX өстәргә кирәкми;югыйсә, ROX коррекциясен өстәргә кирәк.Реагентлар сатып алуда кечкенә партнерлар дөрес ROX сайлау өчен кулланылган корал буенча булырга тиеш, соңрак хаталардан сакланырга.

Реакция системасын әзерләү:

20ул һәм 50ул реакция күләмнәре өстенлек бирелә.Система формалашканда түбәндәге сорауларга игътибар итергә кирәк:

1. Реакция системасы ультра чиста эш урынында, яңа ddH вентиляция белән әзерләнергә тиеш₂O һәр эксперимент өчен кулланыла;

2. Eachәр эксперимент системада пычрану барлыгын тикшерү өчен NTC әзерләргә тиеш, һәм һәр пар праймер системаны әзерләгәндә NTC эшләргә тиеш;

3. РНК шаблонында gDNA калдыклары барлыгын ачыклау өчен, NRT ачыклау өчен һәр үрнәк өчен әзерләнергә мөмкин;

4. Системаны әзерләгәндә, бер үрнәк өчен ким дигәндә 3 техник кабатлау тәкъдим ителә;

5. Шаблон cDNA булганда, qPCR экспериментында кире транскрипция системасының тыю эффектын киметү өчен 5-10 тапкыр эретергә киңәш ителә.Шаблон күләмен градиент буенча өйрәнү яхшырак, КТ бәясе 20-30 арасында төшсен өчен;

6. Кирәкле реакция санын билгеләгез, реакцияләр саны нигезендә 5-10% ка арттырыгыз, күләм конфигурациясе санын исәпләгез;

7, система премикс принцибы ярдәмендә әзерләнә, центрифугациядән соң кушылып, күперләр булмауны тәэмин итә;

8, Кулланыла торган әйберләрне сайлау өчен мөмкин кадәр.

Бәйләнешле RT-qPCR комплекты