RT-qPCR гади PCR технологиясеннән эшләнгән.Ул традицион PCR реакция системасына флуоресцент химик матдәләр (флуоресцент буяулар яки флуоресцент зоналар) өсти, һәм PCR люминесцент механизмнары буенча реаль вакытта PCR аннальләштерү һәм киңәйтү процессын ачыклый.Уртадагы флуоресцент сигнал үзгәрүләре PCRның һәр циклында продукт үзгәрү күләмен исәпләү өчен кулланыла.Хәзерге вакытта иң еш кулланыла торган ысуллар - флюоресцент буяу ысулы һәм тикшерү ысулы.

Флюоресцент буяу ысулы:
Кайбер флуоресцент буяулар, мәсәлән SYBR Green P, PicoGreen, BEBO һ.б., үзләре яктылык җибәрмиләр, ә dsDNAның кечкенә трюкларына бәйләнгәннән соң флуоресцент чыгаралар.Шуңа күрә, PCR реакциясе башында, машина флуоресцент сигналны таба алмый.Реакция аннальинг-киңәйтүгә (ике адымлы ысул) яки киңәйтү этабына (өч адымлы ысул) дәвам иткәндә, бу вакытта икеле полосалар ачыла, һәм яңа ДНК полимеразы Сызык синтезы вакытында флуоресцент молекулалар dsDNA кечкенә трюкта кушылып, флюоресенция чыгаралар.PCR цикллары саны арта барган саен, буяулар dsDNA белән берләшә, һәм флуоресцент сигнал да өзлексез көчәйтелә.SYBR Green мисалын алыгыз.
Тикшерү ысулы:
Такман зонасы - иң еш кулланыла торган гидролиз зонасы.Зондның 5 ′ очында флюоресцент төркем бар, гадәттә FAM.Зонд үзе максатлы генга тулыландыручы эзлеклелек.Флюорфорның 3 ′ очында флуоресцент сүндерү төркеме бар.Флуоресцент резонанс энергия тапшыру принцибы буенча (Фөрстер резонансы энергия тапшыру, ФРЕТ), репортер флуоресцент төркеме (донор флуоресцент молекуласы) һәм сүндерүче флуоресцент группасы (аксессуар флуоресцент молекуласы) Дулкынлану спектры бер-берсенә капланганда һәм ераклык бик якын булганда (7-10нм), донор молекуласының дулкынлануы аккредитация молекуласының флюоресенциясен көчәйтә ала.Шуңа күрә, PCR реакциясе башында, тикшерү бушлай һәм системада булмаганда, хәбәрче флуоресцент төркеме флуоресцент чыгармый.Аннальләштергәндә, праймер һәм зонд шаблонга бәйләнә.Озайту этабында полимераз яңа чылбырларны өзлексез синтезлый.ДНК полимеразының 5′-3 ′ экзонуклаз активлыгы бар.Зондка җиткәч, ДНК полимеразы шаблоннан гидролизлаштырачак, хәбәрче флуоресцент төркемен сүндергеч флюоресцент төркеменнән аерачак һәм флуоресцент сигналны чыгарачак.Проб белән шаблон арасында бер-берең белән бәйләнеш булганлыктан, тикшерү ысулы тестның төгәллеге һәм сизгерлеге ягыннан буяу ысулыннан өстенрәк.

Рәсем 1 qRT-PCR принцибы

Праймер дизайны
Принциплар:

Праймерлар нуклеин кислотасы сериясенең сакланган төбәгендә эшләнергә һәм үзенчәлеккә ия булырга тиеш.

CDNA эзлеклелеген куллану иң яхшысы, һәм mRNA эзлеклелеге дә кабул ителә.Notк икән, ДНК эзлеклелегенең cds өлкәсе дизайнын табыгыз.
Флуоресцент санлы продуктның озынлыгы 80-150bp, иң озынлыгы 300bp, праймер озынлыгы гадәттә 17-25 база арасында, һәм агым һәм агым праймерлары арасындагы аерма артык зур булырга тиеш түгел.

G + C эчтәлеге 40% белән 60% арасында, һәм 45-55% иң яхшысы.
ТМ бәясе 58-62 градус арасында.
Праймер үлчәмнәреннән һәм үз-үзен үлчәмнәрдән сакланырга тырышыгыз, (бер-бер артлы 4 пардан артык өстәмә күренмәгез) чәч структурасы, котылгысыз булса, ΔG <4.5kJ / mol * ясагыз Әгәр кире транскрипция вакытында gDNA бетерелүен тәэмин итә алмасагыз, иң яхшысы, интрон * 3 ′ ахыры, G / GC, G / GC, G / GC)
специфик Гетероген көчәйтелгән эзлеклелектә гомология яхшырак 70% тан кимрәк яки 8 комплектлы төп гомологиягә ия.
Мәгълүматлар базасы:
CottonFGD ачкыч сүзләр белән эзләү
Праймер дизайны:
IDT-qPCR праймериз дизайны

Fig2 IDT онлайн праймериз дизайны коралы бите

3 нче рәсем нәтиҗәләре
LncRNA праймериз дизайны:
lncRNA:mRNA кебек үк адымнар.
miRNA:Stem-loop ысулы принцибы: Барлык miRNA-лар якынча 23 нт кыска эзлеклелектә булганлыктан, турыдан-туры PCR ачыклау мөмкин түгел, шуңа күрә stem-loop эзлеклелеге коралы кулланыла.Ботак-цикл эзлеклелеге - бер чәчле ДНК, якынча 50 нт, ул үзе чәч структурасын барлыкка китерә ала.3 'Ахыры miRNA өлешчә фрагментны тулыландыручы эзлеклелектә эшләнергә мөмкин, аннары максатлы miRNA кире транскрипция вакытында тамыр-цикл эзлеклелегенә тоташырга мөмкин, һәм гомуми озынлыгы 70bp җитә ала, бу qPCR белән билгеләнгән көчәйтелгән продукт озынлыгына туры килә.MiRNA праймериз дизайны.
Көчләндерү өчен махсус ачыклау:
Онлайн шартлау базасы: CottonFGD эзлеклелеге эзлеклелеге буенча шартлау
Localирле шартлау: җирле шартлау өчен Blast + кулланыгыз, linux һәм макос турыдан-туры җирле мәгълүмат базасын булдыра ала, win10 системасы шулай ук ​​ubuntu bash урнаштырганнан соң эшләнергә мөмкин.Localирле шартлау базасы һәм җирле шартлау булдыру;win10да ubuntu bash ачу.
Игътибар: Биек мамык һәм диңгез утравы мамыклары - тетраплоид культуралары, шуңа күрә шартлау нәтиҗәсе еш кына ике яки күбрәк матч булачак.Элек NAU cds-ны шартлау өчен мәгълүмат базасы итеп куллану, мөгаен, берничә SNP аермасы булган ике гомологик ген табарга мөмкин.Гадәттә, ике гомологик генны праймериз дизайны белән аерып булмый, шуңа күрә алар бер үк карала.Әгәр дә ачык индел бар икән, праймер гадәттә инделда эшләнгән, ләкин бу праймерның икенчел структурасына китерергә мөмкин Ирекле энергия көчәя, көчәйтү эффективлыгы кимүгә китерә, ләкин бу котылгысыз.

Праймер икенчел структурасын ачыклау:
Адымнар:олиго 7 → кертү шаблон эзлеклелеге → суб-тәрәзәне ябу → саклау → шаблонда праймерны табу, пример озынлыгын билгеләү өчен ctrl + D басыгыз → үз-үзен димеризацияләү органы, гетеродимер, чәч бөртеге, туры килмәү һ.б. кебек төрле икенчел структураларны анализлау.Алгы праймерның нәтиҗәләре яхшы, ачык димер һәм чәч структурасы юк, өзлексез тулыландыручы нигезләр юк, һәм ирекле энергиянең абсолют бәясе 4,5тән дә ким түгел, арткы праймер өзлексез күрсәтә 6 база тулыландыручы, ирекле энергия - 8,8;өстәвенә, 3 ′ ахырында җитдирәк димер, 4 эзлекле база димеры барлыкка килә.Ирекле энергия югары булмаса да, 3 ′ үлчәмле Chl көчәйтү үзенчәлегенә һәм көчәйтү эффективлыгына җитди йогынты ясый ала.Моннан тыш, чәч кадакларын, гетеродимерларны, туры килмәүне тикшерергә кирәк.

Fig3 oligo7 ачыклау нәтиҗәләре
Көчләндерү эффективлыгын ачыклау:
PCR реакциясенең көчәйтү эффективлыгы PCR нәтиҗәләренә җитди йогынты ясый.Шулай ук ​​qRT-PCR, көчәйтү эффективлыгы сан нәтиҗәләре өчен аеруча мөһим.Реакция буферындагы бүтән матдәләрне, машиналарны һәм протоколларны чыгарыгыз.Праймерларның сыйфаты шулай ук ​​qRT-PCR көчәйтү эффективлыгына зур йогынты ясый.Нәтиҗәнең төгәллеген тәэмин итү өчен, чагыштырмача флуоресцент күләме дә, абсолют флуоресцент күләме дә праймерларның көчәйтү эффективлыгын ачыкларга тиеш.Танылган, эффектив qRT-PCR көчәйтү эффективлыгы 85% белән 115% арасында.Ике ысул бар:
1. Стандарт сызык ысулы:
а.CDNA кушыгыз
б.Градиент эретү
c.qPCR
г.Көчәйтү эффективлыгын исәпләү өчен сызыклы регрессия тигезләмәсе
2. LinRegPCR
LinRegPCR - реаль вакыт RT-PCR мәгълүматларын анализлау программасы, SYBR Green яки охшаш химия нигезендә санлы PCR (qPCR) мәгълүматлары дип атала.Программа база булмаган коррекцияләнгән мәгълүматны куллана, һәр үрнәк буенча төп коррекция ясый, тәрәзә тәрәзәсен билгели, аннары PCR мәгълүматлар җыелмасы аша туры сызыкка туры килү өчен сызыклы регрессия анализын куллана.Бу сызык түбәсеннән PCR индивидуаль үрнәгенең эффективлыгы исәпләнә.Ампликонга уртача PCR эффективлыгы һәм үрнәк буенча Ct кыйммәте флуоресцент берәмлекләрдә күрсәтелгән үрнәккә башлангыч концентрацияне исәпләү өчен кулланыла.Мәгълүмат кертү һәм чыгару Excel электрон таблицасы аша.Бары тик үрнәк
катнашу кирәк, градиент юк
адымнар кирәк:(Мисал итеп Bole CFX96 алыгыз, ачык ABI белән машина түгел)
эксперимент:бу стандарт qPCR эксперименты.
qPCR мәгълүмат чыгару:LinRegPCR чыгару файлларының ике формасын таный ала: RDML яки санлаштыру көчәйтү нәтиҗәсе.Чынлыкта, бу цикл санының һәм флюоресенция сигналының реаль вакытта ачыклау кыйммәте, һәм көчәйтү сызыклы сегмент эффективлыгының флуоресцент үзгәрү кыйммәтен анализлау ярдәмендә алына.
Мәгълүмат сайлау: Теория буенча, RDML кыйммәте кулланылырга тиеш.Минем санакның проблемасы - программа тәэминаты RDMLны таный алмый, шуңа күрә мин оригиналь мәгълүмат буларак Excel чыгару кыйммәтенә ия.Башта мәгълүматларның тупас скринкасын ясарга киңәш ителә, мәсәлән, үрнәкләр кертмәү һ.б. Нокталарны чыгару мәгълүматларында бетерергә мөмкин (әлбәттә, сез аларны бетерә алмыйсыз, LinRegPCR бу пунктларны соңрак этапта санга сукмый)

Fig5 qPCR мәгълүмат экспорты

Кандидат үрнәкләрен сайлау

Мәгълүмат кертү:Квалификация көчәйтү нәтиҗәләрен ачу.xls, Lin LinRegPCR → файлны ачу → Excelтан уку → 7 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә параметрларны сайлау → Ярар → басыгыз

LinRegPCR мәгълүмат кертүнең 7 нче адымнары

Нәтиҗә:Әгәр дә кабатлау булмаса, төркемләү кирәк түгел.Әгәр дә кабатлау булса, төркемләү үрнәк төркемләүдә редакцияләнергә мөмкин, һәм генның исеме идентификаторга кертелә, һәм шул ук ген автоматик рәвештә төркемләнәчәк.Ниһаять, файлга басыгыз, Excel экспортлагыз һәм нәтиҗәләрне карагыз.Wellәр скважинаның көчәйтү эффективлыгы һәм R2 нәтиҗәләре күрсәтеләчәк.Икенчедән, төркемнәргә бүленсәгез, төзәтелгән уртача көчәйтү эффективлыгы күрсәтеләчәк.Primәр праймерның көчәйтү эффективлыгы 85% белән 115% арасында булуын тәэмин итегез.Әгәр дә ул бик зур яки бик кечкенә булса, бу праймерның көчәйтү эффективлыгы начар дигән сүз.

Рәсем 8 Нәтиҗә һәм мәгълүмат чыгару

Эксперименталь процесс:
РНК сыйфаты таләпләре:
Чисталык:1.72.0 калдыклы изотиокянат булырга мөмкинлеген күрсәтә.Чиста нуклеин кислотасы A260 / A230 2 тирәсе булырга тиеш .Әгәр 230 нм көчле үзләштерү булса, бу фенат ионнары кебек органик кушылмалар барлыгын күрсәтә.Моннан тыш, аны 1,5% агароза гели электрофорезы белән ачыкларга мөмкин.Маркерны күрсәтегез, чөнки ssRNAның денатурасы юк һәм молекуляр авырлык логарифмының сызыклы бәйләнеше юк, һәм молекуляр авырлык дөрес күрсәтелми.Концентрация: теоретик яктантүгел100нг / улдан ким, концентрация бик түбән булса, чисталык гадәттә түбән түгел

Фигура 9 РНК гели

Моннан тыш, үрнәк кыйммәтле булса һәм РНК концентрациясе югары булса, аны чыгарганнан соң аликотка ясарга һәм кире транскрипция өчен РНКны 100-300ng / ul концентрациясенә эретергә киңәш ителә.Керүкире транскрипция процессы, mRNA транскрипцияләнгәндә, полиА койрыкларына махсус бәйләнә алган олиго (dt) праймерлар кире транскрипция өчен кулланыла, ә lncRNA һәм circRNA очраклы гексамер (очраклы 6 мер) примерларын гомуми РНКның кире транскрипциясе өчен кулланалар, miRNA өчен, miRNA-махсус муен-цикл праймерлары кире транскрипция өчен кулланыла.Күпчелек компанияләр хәзер махсус койрык комплектларын эшләтеп җибәрделәр.Stem-loop ысулы өчен койрыклау ысулы уңайлырак, югары үткәрүчән һәм реагентны саклаучы, ләкин бер үк гаиләнең miRNA-ларын аеру эффекты stem-loop ысулы кебек яхшы булырга тиеш түгел.Eachәрбер кире транскрипция комплектында генга хас праймериз концентрациясенә таләпләр бар (сабаклар).MiRNA өчен кулланылган эчке белешмәлек U6.Ботинка әйләнеше инверсия процессында U6 трубасы аерым кире кайтарылырга тиеш, һәм U6ның алгы һәм арткы примерлары турыдан-туры кушылырга тиеш.CircRNA да, lncRNA да HKGларны эчке белешмә буларак куллана ала.КерүcDNA ачыклау,
РНК белән проблема булмаса, cDNA да яхшы булырга тиеш.Ләкин, экспериментның камиллеге алып барылса, gDNA-ны CD-тан аера ала торган эчке белешмә ген (белешмә ген, RG) куллану яхшырак.Гадәттә, RG - хуҗалык гены., HKG) 10-нчы рәсемдә күрсәтелгәнчә;Ул вакытта мин соя саклаучы протеин ясый идем, һәм эчке белешмә буларак интрон булган актин7 кулландым.GDNAдагы бу праймерның көчәйтелгән фрагментының зурлыгы 452bp иде, ә cDNA шаблон буларак кулланылса, ул 142bp иде.Аннары тест нәтиҗәләре ачыкланды, cDNA өлеше чыннан да gDNA белән пычранган, һәм шулай ук ​​кире транскрипция нәтиҗәсендә проблема юклыгын исбатлаган, һәм аны PCR шаблоны итеп кулланырга мөмкин.Агароза гели электрофорезын турыдан-туры cDNA белән эшкәртү файдасыз, һәм ул таралучы тасма, ышандырырлык түгел.

10-нчы рәсем

QPCR шартларын билгеләүгадәттә комплект протоколы буенча проблема юк, нигездә tm кыйммәте адымында.Әгәр кайбер праймерлар праймериз дизайны вакытында яхшы эшләнмәсәләр, tm бәясе белән теоретик 60 ° C арасында зур аерма килеп чыкса, cDNA үрнәкләр кушылганнан соң, праймериз белән градиент PCR эшләгез, һәм температураны TM бәясе итеп полосаларсыз сакларга тырышыгыз.

Мәгълүмат анализы

Гадәттәге чагыштырма флуоресцент санлы PCR эшкәртү ысулы нигездә 2 буенча-ΔΔCT.Мәгълүмат эшкәртү шаблоны.

Бәйләнешле продуктлар:

Реаль Вакыт PCR җиңел^TM Aq Такман

Реаль Вакыт PCR җиңел^TM YСЫБР Яшел I.

RT Easy I (cDNA синтезы өчен мастер премикс)

RT Easy II (qPCR өчен cDNA синтезы өчен мастер премикс)