Ачыклау үзенчәлеге

Күпчелек очракта, праймериз дизайнының максаты - PCR үзенчәлеген арттыру.Бу күп үзгәрүчәннәрнең алдан әйтелгән тәэсире белән билгеләнә.Бер мөһим үзгәрүчән - праймерның 3′end эзлеклелеге.

Иң мөһиме, спецификация өчен эшләнгән PCR анализлары киң динамик диапазонда югары эффективлыкны саклап калырга мөмкин, чөнки анализ махсус көчәйткеч продуктлар җитештерми, шуның белән PCR реагентлары белән көндәшлек итә яки төп көчәйтү реакциясен тоткарлый.

Әлбәттә, кайбер очракларда спецификация иң мөһиме түгел, мәсәлән, максат тыгыз бәйләнештә булганда, ләкин төрле патогеннар, махсус дизайн, оптимизация һәм тикшерү стандартлары кирәк булганда.

Эретү сызыгы - ампликоннарның үзенчәлеген бәяләү өчен стандарт ысул, ким дигәндә бер максатны көчәйтү ягыннан.Ләкин, ассызыкларга кирәк, эретү кәкреләре адаштырырга мөмкин, чөнки, мәсәлән, алар субоптималь примерларның һәм түбән шаблон концентрацияләренең берләштерелгән эффектлары тәэсирендә булырга мөмкин.

P5 |Эретү сызыгы ике максатлы ДНКның ике күләмен ачыклаудан алынган ТМ сменаларын күрсәтә.

A. higherгары концентрацияләрдә (реклама), qPCR үлчәү тәмамланганнан соң, ачык пример димеры юк.Шаблон концентрациясе 50 данәгә кадәр кимегәндә, специаль булмаган продукт пәйда була һәм иң түбән концентрациядә (f) бердәнбер продукт булып китә.

B. Тест барлык максат концентрацияләрендә бер үк ТМСны яздырды, һәм иң түбән концентрациядә дә ачык пример димеры юк иде (5 данә).Бу ике ачыклау ысулын кулланганда, НТСларда көчәйтү продуктлары табылмады.

P5 шаблон төрле концентрацияләрдә булган үрнәкләр белән алынган эретү кәкреләрен күрсәтә.P 5a күрсәтә, иң түбән ике концентрациядә, җитештерелмәгән специфик көчәйткеч продуктларның Tms конкрет ампликоннарныкыннан түбәнрәк.

Билгеле, бу ачыклау ысулы түбән концентрациядә булган максатларны ачыклау өчен ышанычлы кулланыла алмый.

Кызык, НТСлар, ягъни ДНКлары булмаган үрнәкләр, көчәйтелмәгән продуктларны яздырмаганнар, бу геном ДНКның махсус булмаган көчәйтү / полимеризациядә катнаша алуын күрсәтә.

Кайвакыт мондый фон праймериз һәм специфик булмаган көчәйтүне төзәтеп булмый, ләкин еш кына шаблон концентрациясендә һәм NTC (P 5b) специфик көчәйткеч булмаган ачыклау ысулын эшләп була.

Монда, хәтта максатлы концентрациянең көчәйтүен Cq 35 белән яздырып, билгеле бер таркату сызыгы барлыкка киләчәк.Нәкъ шулай ук, НТС специаль булмаган көчәйтү билгеләрен күрсәтмәде.Кайвакыт, ачыклау тәртибе ана эчемлегенә бәйле булырга мөмкин, һәм буфер композицияләрендә специаль булмаган көчәйтү генә табыла, алар төрле Mg2 + концентрацияләре белән бәйле булырга мөмкин.

Ачыклау тотрыклылыгы

Ta оптимизациясе - qPCR ачыклауның эмпирик тикшерү һәм оптимизация процессында файдалы адым.Бу NTC көчәйтмичә иң түбән Cq җитештерүче температураны (яки температура диапазонын) күрсәтеп, праймерның ныклыгын турыдан-туры күрсәтә.

Сәнгатьчәнлекнең ике-дүрт кат аермасы югары mRNA экспрессияле кешеләр өчен мөһим булмаска мөмкин, ләкин диагностик тестлар өчен бу уңай һәм ялган тискәре нәтиҗәләр арасындагы аерманы аңлатырга мөмкин.

QPCR праймерларының Ta үзлекләре төрлечә булырга мөмкин.Кайбер тестлар бик нык түгел, һәм алар праймерларның оптималь бәясе буенча башкарылмасалар, алар тиз таркалырлар.

Бу бик мөһим, чөнки бу төр ачыклау реаль дөньяда еш проблемалы, һәм үрнәкнең чисталыгы, ДНК концентрациясе яки башка ДНК булуы оптималь булмаска мөмкин.

Моннан тыш, максатчан күчермә саны киң диапазонда төрле булырга мөмкин, һәм реагентлар, пластик савыт-саба яки приборлар сынауны урнаштырганда кулланылганнардан аерылып торырга мөмкин.

P6 | Температура градиенты PCR ачыклауның төрле ныклыгын күрсәтә.

A. Биолинның Sensifast SYBR мастермиксын (каталог номеры BIO-98050) кулланыгыз, кеше миенең РНКыннан әзерләнгән CDNAда PCR башкару өчен.

B. Био-Радның CFX qPCR коралын кулланыгыз, апаленның көчәйтү картасын һәм таркату сызыгын языгыз (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 көчәйтү графигы һәм эретү сызыгы (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP көчәйтү графигы һәм таркату сызыгы (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs төрле аннальинг температураларында язылган, 7C температура градиенты астында язылган Cq ​​аермасын күрсәтә.

P 6 теләмәгән тестның типик нәтиҗәсен күрсәтә, монда qPCR 59C белән 67C (P 6a) арасында градиент Tas кулланып, кеше миенә хас өч ген өчен праймериз ярдәмендә башкарылды.

Күчерү графигыннан күреп була, Опалин праймерлары идеальдән ерак, чөнки аларның оптималь Ta диапазоны бик тар (6б рәсем), ягъни Cqs киң таралган, нәтиҗәдә Cqs оптималь Cqs Түбән белән чагыштырыла.

Бу ачыклау ысулы тотрыксыз һәм субоптималь көчәйтүгә китерергә мөмкин.Шуңа күрә бу пар праймериз яңадан эшләнергә тиеш.Моннан тыш, эретү сызыгы анализы (инсетт) күрсәтә, бу ачыклау ысулының үзенчәлеге дә проблемалы булырга мөмкин, чөнки һәр Та эретү сызыгы төрле.

P 6c'та күрсәтелгән ACSBG1 ачыклау ысулы югарыдагы Опалинны ачыклау ысулына караганда көчлерәк, ләкин ул әле идеальдән ерак, һәм аны яхшырту мөмкинлеге бар.

Ләкин, без ассызыклыйбыз, ныклык һәм спецификация арасында кирәкле бәйләнеш юк, чөнки бу ачыклау ысулы белән чыгарылган эретү сызыгы барлык Тас (инсетта) бер үк иң югары кыйммәтне күрсәтә.

Икенче яктан, ныклык тесты күпкә толерант, P 6d күрсәтелгән GFAP тестындагы кебек, Tasның киң спектрында охшаш Cqs җитештерә.

Шул ук 8 градус Celельсий диапазонында алынган Cqs аермасы 1 дән дә ким түгел, һәм эретү сызыгы (инсетт) бу температура диапазонында ачыклау үзенчәлекләрен раслый.Әйтергә кирәк, исәпләнгән Tas һәм фактик Ta диапазоны бик төрле булырга мөмкин.

Тикшерүчеләргә эффектив праймериз ясарга булышу өчен эшләнгән бик күп күрсәтмәләр бар, аларның күбесе күптән билгеләнгән кагыйдәләргә нигезләнгән һәм праймеризның 3-нче өлешенә зур игътибар бирелгән.Еш кына G яки Cны 3 'ахырына һәм ике G яки C базасын (GC кыскыч) кертергә киңәш итәләр, ләкин соңгы 5 базаның икесеннән артык түгел.

Гамәлдә, бу кагыйдәләр тикшерүчеләргә юл күрсәтә ала, ләкин алар барлык шартларда да дөрес түгел.

P7 |Праймерның 3′end үзенчәлеккә яки эффективлыкка аз тәэсир итә.

A. HIF-1α (NM_181054.2) ген өчен праймерларның торышы.

B. Agilent Brilliant III SYBR яшел ана эчемлеген кулланыгыз (мәче No. 600882) алты сынау пунктын көчәйтү өчен.

C. Био-Радның CFX qPCR инструменты һәм 3′end праймерлары белән язылган көчәйтү графигы һәм эретү сызыгы.NTC кызыл төстә күрсәтелгән.

D. Cqs һәр тест пунктының язмасы

Мәсәлән, P 7 нәтиҗәләре 3′end кагыйдәсенә каршы килә.Барлык конструкцияләр дә бер үк нәтиҗәләр бирә, ике пример комбинациясе белән NTC-ның специаль булмаган көчәйтүенә китерә.

Ләкин, без GC клип эффектын хуплый алмыйбыз, чөнки бу очракта A яки T максимум 30 база итеп куллану үзенчәлекне киметми.

C тесты, F праймеры GGCC белән тәмамланган, CQ-ны NTC'ларда яздырган, бу 30-ахырында бу эзлеклелектән качарга теләгәнен күрсәтә.Без ассызыклыйбыз, пример парының иң яхшы 3′end эзлеклелеген билгеләү өчен бердәнбер ысул - кайбер кандидат праймерларын эксперименталь бәяләү.

Көчләндерү эффективлыгы

Иң мөһиме, специфик булмаган PCR ачыклау беркайчан да конкрет була алмаса да, көчәйтү эффективлыгы ферментны, ана эчемлеген, өстәмәләрне, велосипед шартларын үзгәртеп, төрлечә көйләнергә һәм максимальләштерелергә мөмкин.

PCR ачыклау нәтиҗәлелеген бәяләү өчен, нуклеин кислотасының 10 яки 5 тапкыр серияле эремәсен куллану яхшырак, ягъни “стандарт сызык ысулы”.

Әгәр дә PCR ампликоннары яки синтетик ДНК максатлары стандарт сызык ясау өчен кулланылса, бу максатларның серияле эрешмәләре даими фон ДНК белән кушылырга тиеш (геном ДНК кебек).

P8 |PCR эффективлыгын бәяләү өчен эретү сызыгы.

A. HIF-1 өчен праймериз кулланыгыз: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA һәм R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC һәм Agilent's Brilliant III SYBR Яшел мастермикс (каталог номеры 600882) PCR һәм эретү шартлары өчен.

Б.Эретү сызыгы инсетта күрсәтелә.

C. ТР реакциясе, эретү һәм серияле эретү икенче cDNA үрнәге өчен кабатланды, нәтиҗәләре охшаш иде.

P 8 ике стандарт сызыкны күрсәтә, ике төрле CDNA үрнәгендә бер үк ачыклау ысулын кулланып, нәтиҗә бер үк эффективлык, якынча 100%, һәм R2 кыйммәте дә охшаш, ягъни эксперименталь мәгълүматлар белән регрессия сызыгы яки туры сызык дәрәҗәсе.

Ике стандарт сызык чагыштырыла, ләкин төгәл түгел.Максат максатны төгәл санау булса, шуны әйтергә кирәк: билгесезлекне аңлатмыйча, копия санын исәпләү тәкъдим ителми.

P9 |Стандарт сызык ярдәмендә санлаштыру белән бәйле үлчәү билгесезлеге.

A. PCR һәм эретү кәкре шартларын башкару өчен GAPDH (NM_002046) өчен праймериз кулланыгыз.F: ACAGTTGCCATGTAGACC һәм R: TAACTGGTTGAGCACAGG һәм Биолинның Sensifast SYBR мастермикс (каталог номеры BIO-98050).

B. Био-Радның CFX qPCR коралы белән язылган көчәйтү схемасы, эретү сызыгы һәм стандарт сызык.

C. Стандарт сызык графигы һәм 95% ышаныч интервалы (CI).

D. Күчереп алу саны һәм өч Cq кыйммәтенең 95% ышаныч интервалы.

P 9 күрсәтә, оптимальләштерелгән сынау өчен, бер стандарт сызыкның табигый үзгәрүчәнлеге якынча 2 тапкыр (95% ышаныч интервалы, минимумнан максимум), бу көтелгән иң кечкенә үзгәрүчәнлек булырга мөмкин.

Бәйләнешле продукт:

Күзәнәк туры RT qPCR комплекты

Тычкан койрыгы туры PCR комплекты

Хайваннар тукымасы туры PCR комплекты