Барысы да qRT-PCR эксперименты принцибы, праймериз дизайны, нәтиҗәләрне аңлату һ.б. турында сөйләшәләр, ләкин мин сезнең белән qRT-PCR эксперименталь операциясе белән уртаклашырга тиеш дип уйлыйм.Бу кечкенә, ләкин нәтиҗәләр турында.

QRT-PCR эшләгәнче, без үзебезнең РНКны һәм эш ысулларын төгәл аңларга тиеш.Безнең тырышлык практикага түгел, ә нәтиҗәләргә юнәлтелгән бит.Шулай итеп, qRT-PCR эшләгәнче, безгә түбәндәге сорауларны билгеләргә кирәк (аларның кайберләре SYBR өчен генә кулланыла).

1 Сезнең РНК бозылмаганына ышанасызмы?

NanoDrop 2000 РНК концентрациясен һәм чисталыгын гына ачыклый ала, ләкин РНКның бөтенлеген ачыклый алмый.

РНК (RNA Intesity Number) кыйммәте Agilent 2100 биоанализер системасы тарафыннан ачыкланган РНКның бөтенлеген күрсәтә ала.

Төрле РНК үрнәкләре өчен RIN кыйммәтләренең схематик схемасы (эукариотлар)

Ләкин, лабораторияләрдә, гадәттә, Agilent 2100 биоанализеры юк.Бу очракта без формальдегид гели аша ачыклый алабыз, ләкин РНКның гомуми күләменә таләп зур, шуңа күрә иң тиз ысул - гади гель электрофорезын куллану.Нуклеазсыз мохиттә булырга кирәк, шуңа күрә электрофорез танкын, шешә шешәсен, гель кашанны һәм таракны DEPC суы белән юарга кирәк.Агароза шулай ук ​​нуклеизсыз (яңа ачылган вакытта), һәм Йөкләү буферы мөмкин кадәр яңа ачылырга тиеш, 1,2% гель.

Игътибар итегез, гель тулысынча эретелергә тиеш, югыйсә ул бертөрле булмаган полосаларга китерәчәк, рәсемдәге 9 нчы үрнәктә күрсәтелгәнчә.Әгәр көчәнеш артык зур булса яки бик озак эшләсә, җылылык барлыкка килер һәм РНК деградациясенә китерер, шуңа күрә көчәнеш һәм вакыт акыллы контрольдә тотылырга тиеш.Моннан тыш, гел эшкәртү шулай ук ​​үрнәктә ДНК калдыклары барлыгын ачыклый ала, һәм тарату скважинасында сакланган полосаларның күплеген күзәтә ала.

Рәсем.Гель электрофорезы РНКны ачыклау

2 Сез CDNA концентрациясенә ышанасызмы?

Лабораториядәге олы абыйларның тәҗрибәсе шунда ки, һәр инверсия белән алынган 20 ул системаның CDNA турыдан-туры 20X, докторантура апалары 10X эретелгән.Мин гадәттә хәлгә бәйле.Personәрбер кеше искә алган РНКның сыйфаты төрле булганга, кире кайту дәрәҗәсе дә төрле, һәм кире технология тотрыклы булмаска мөмкин.

Шулай итеп, кире CDNA алган саен, мин аны якынча 3 тапкыр эретәчәкмен, аннары RT-PCR ясау өчен хуҗалык генын кулланам, цикл саны гадәттә 25 цикл, конкрет концентрацияне ачыклау, аннары соңгы эретү факторын билгеләү.

3 Праймерларны куллану җиңел дип ышанасызмы?

Ул qRT-PCR эретү сызыгын уза ала, ләкин моның өчен акча кирәк.Күп акчасыз лабораторияләр өчен, алар бик күп праймерлар алгач, гади RT-PCR куллана алалар, аның бер төркем булу-булмавын һәм праймерларның үзенчәлеген ачыклау.Әгәр дә лаборатория акчадан аз булмаса, барлык праймерларның үзенчәлеген эретү сызыгы аша бер тапкыр ачыкларга мөмкин.

4 Сезнең эксперимент шартларыгыз яраклы дип ышанасызмы?

SYBR көчле яктылыктан сакланырга тиеш, шуңа күрә SYBR реагентын өстәгәндә өстән яктылыкны сүндерергә тырышыгыз, һәм аны тәмамлау өчен караңгы яктылык кулланырга кирәк.

SYBRны 4 ° C саклагыз.Кулланылганда, күбекләнүдән саклану өчен, әкрен-әкрен өскә-аска әйләндерегез, көчле вортекска кермәгез.

Кайбер яшь апалар үрнәкләрне катнаштырудан куркып PCR тактага билгеләр ясарга яраталар, бу дөрес түгел.Сезнең маркерлар флуоресцент сигналлар җыюга бик тәэсир итә, шуңа күрә мин гадәттә яшүсмерләргә эксперименталь дәфтәрләрне хәтердә булышырга тәкъдим итәм, аста күрсәтелгәнчә.

Рәсем.qRT-PCR йөкләү схемасы

5 Сез моны дөрес эшлисезме?

Перчаткалар киегез, перчаткалар киегез, перчаткалар киегез, мөһим нәрсәләрне өч тапкыр әйтегез.

SYBR яктылыгына тәэсирен киметү өчен, мин шәхсән башта шаблон өстәргә яратам, астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә.Тәҗрибә буенча, аз күләмле шаблон өстәү, сайлау хаталарына китерергә мөмкин.Шуңа күрә, аз шаблон өстәп килеп чыккан хатаны киметү өчен, мин гадәттә кабат үрнәкне икеләтә алам, һәм H2O2 кушылган күләмне киметү өчен үрнәк өстәгәндә сумманы икеләтә арттырам.

Рәсем.QRT-PCR йөкләү схематик схемасы

Аннары qRT-PCR системасын түбәндәгечә конфигурацияләгез.

Рәсем.qRT-PCR системасын әзерләү схемасы

Искәрмә: конфигурация процессы боз өстендә эшләнергә тиеш.

Ampleрнәкне өстәгәннән соң, үтә күренмәле мөһер пленкасын ябыштырыгыз.Кулларыгыз белән үтә күренмәле мөһер пленкасына кагылмаска тырышыгыз, фильмның ике ягында урнашкан урыннан эшләгез.Чөнки бармак эзләре флуоресцент сигналлар җыюга да тәэсир итә ала.Аннары центрифуга кулланыгыз, центрифуга тиз арада 10 с тизлектә, үрнәк стенага асылмасын өчен.

Бәйләнешле продуктлар:

Күзәнәк туры RT-qPCR комплекты

RT Easy II