Real Time PCR, санлы PCR яки qPCR дип тә атала, PCR көчәйтү продуктларын реаль вакытта мониторинглау һәм анализлау ысулы.
Санлы PCR гади эш өстенлекләренә ия, тиз һәм уңайлы, югары сизгерлек, яхшы кабатлану һәм түбән пычрану дәрәҗәсе, ул медицина тикшерүендә, наркотикларның эффективлыгын бәяләүдә, ген экспрессиясен тикшерүдә, трансгеник тикшеренүләр, ген табу, патоген ачыклау, хайваннар һәм үсемлекләрне ачыклауда киң кулланыла., азык-төлек тесты һәм башка өлкәләр.
Шуңа күрә, сез тормыш фәннәрендә төп тикшеренүләр белән шөгыльләнәсезме, яисә фармацевтика компанияләре, терлекчелек компанияләре, азык-төлек компанияләре, хәтта керү-тикшерү инспекциясе һәм карантин бюролары, әйләнә-тирә мохитне күзәтү бүлекләре, больницалар һәм бүтән бүлекләр хезмәткәрләре, сез күбрәк яки аз санлы PCR үзләштерү белемнәрен белергә тиеш.

Real Time PCR принцибы

Real Time PCR - PCR реакция системасына флуоресцент матдәләр кушылган ысул, һәм PCR реакциясе процессындагы флуоресцент сигнал интенсивлыгы санлы PCR инструменты белән реаль вакытта күзәтелә, һәм ниһаять, эксперименталь мәгълүматлар анализлана һәм эшкәртелә.

【Көчләндерү сызыгы】PCR динамик процессын тасвирлаучы сызык.PCR-ның көчәйтү сызыгы чыннан да стандарт экспоненциаль сызык түгел, ә сигмоид сызыгы.

[Көчләндерү сызыгының платформа этабы]PCR цикллары саны арту, ДНК полимеразын инактивлаштыру, dNTP һәм праймерларның бетүе, һәм продукт пирофосфаты реакциясе белән синтез реакциясен тыю белән, PCR һәрвакыт тиз арада киңәя алмый., һәм ахыр чиктә платога керәчәк.

[Көчләндерү кәкресенең экспоненциаль үсеш өлкәсе]Плато фазасы төрлечә үзгәрсә дә, көчәйтү сызыгының экспоненциаль үсеш өлкәсенең билгеле бер төбәгендә кабатлану бик яхшы, бу PCR санлы анализ өчен бик мөһим.

[Бусага бәясе һәм Ct бәясе]Флуоресцентны ачыклауның лимит бәясен көчәйтү кәкресенең экспоненциаль үсеш өлкәсендә тиешле урында куябыз, бусага бәясе (Бусага).Бусага бәясе һәм көчәйтү сызыгы киселеше - Ct кыйммәте, ягъни Ct кыйммәте бусага бәясе җиткәч цикллар санын күрсәтә.

Түбәндәге график бусага сызыгы һәм көчәйтү сызыгы, бусага һәм Ct кыйммәте арасындагы бәйләнешне ачык күрсәтә.

【Ничек санарга?】

Бу математик теория белән расланган, Ct кыйммәтенең башлангыч шаблоннар санының логарифмасы белән кире сызыклы бәйләнеше бар.Real Time PCR PCR көчәйтү продуктларын реаль вакытта күзәтә һәм экспоненциаль көчәйтү этабында саный.

PCRның һәр циклы өчен ДНК 2 тапкыр артты һәм тиздән платога җитте.

ДНК башлау күләме А дип уйлау₀ , n циклыннан соң, ДНК продуктының теоретик күләме түбәндәгечә күрсәтелергә мөмкин:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Аннары, А 0 башлангыч ДНК күләме никадәр күбрәк булса, көчәйтелгән продукт күләме ачыклау кыйммәтенә тизрәк ирешә, һәм An җиткәч цикл саны Ct кыйммәте.Ягъни, башлангыч 0 ДНК күләме никадәр күбрәк булса, көчәйтү сызыгы иртәрәк күтәрелә, һәм тиешенчә n цикллары саны азрак.

Без билгеле концентрация стандартының градиент эремәсен үткәрәбез һәм аны Real Time PCR шаблоны итеп кулланабыз, һәм ДНК күләмен азрак башлау тәртибендә көчәйтү кәкреләре тигез интервалларда алыначак.Ct кыйммәте һәм башлангыч шаблоннар санының логарифмасы арасындагы сызыклы бәйләнеш буенча, а[стандарт сызык] булдырырга мөмкин.

Ampleрнәкнең Ct кыйммәтен билгесез концентрация белән стандарт сызыкка алыштырып, үрнәкнең башлангыч шаблон күләмен билгесез концентрация белән алырга мөмкин, бу Real Time PCR санлы принцибы.

Real Time PCR-ны ачыклау ысулы

Real Time PCR реакция системасында флюоресенция интенсивлыгын ачыклап PCR көчәйтү продуктларын ачыклый.

Флуоресцент буяу урнаштыру ысулы принцибы】

Флюоресцент буяулар, TB Green ® кебек, PCR системаларында ике катлы ДНКны бәйләргә һәм бәйләгәндә флуоресны махсус бәйләргә мөмкин.

Реакция системасындагы флюоресенция интенсивлыгы PCR цикллары арту белән тиз арада артты.Флюоресенция интенсивлыгын ачыклап, реакция системасында ДНК көчәйтү күләмен реаль вакытта күзәтеп була, аннары үрнәктә башлангыч шаблон күләмен кире бәяләргә мөмкин.

【Флуоресцент тикшерү ысулы принцибы】

флуоресцент тикшерүнуклеин кислотасы эзлеклелеге - 5 ′ очында флюоресцент группа һәм 3 ′ очында сүндерү төркеме, алар шаблонга махсус бәйләнә ала.Зонд тотрыклы булганда, флюорфор чыгарган флуоресцент сүндерү төркеме белән сүндерелә һәм флюорес була алмый.Зонд бозылгач, флуоресцент матдә аерылачак һәм флуоресцент чыгарылачак.

PCR реакция эремәсенә флюоресцент зонд кушыла.Анналь процесс вакытында флуоресцент зонасы шаблонның конкрет позициясенә бәйләнәчәк.Озайту процессында, PCR ферментының 5 ′ → 3 ′ экзонуклаз активлыгы шаблон белән гибридлаштырылган флуоресцент зонаны таркатырга мөмкин, һәм флуоресцент матдә флуоресцент чыгару өчен аерыла.Реакция системасындагы зонаның флюоресенция интенсивлыгын ачыклап, PCR продуктының көчәйтү күләмен күзәтү максатына ирешергә мөмкин.

【Флуоресцентны ачыклау ысулын сайлау】

Әгәр дә ул югары гомология белән эзлеклелекне аеру өчен һәм SNP язу анализы кебек мультиплекслы PCR ачыклау өчен кулланылса, флуоресцент тикшерү ысулы алыштыргысыз.
Башка Real Time PCR экспериментлары өчен гади, җиңел һәм аз чыгымлы флуоресцент химера ысулы кулланылырга мөмкин.

Мультиплекслы PCR сәләтле көчле үзенчәлекләр

Кимчелек

Көчәйтү өчен югары үзенчәлек таләпләре;

мультиплекслы PCR башкарып булмый.

кайвакыт тикшерү дизайны авыр

Бәйләнешле продуктлар: