Флуоресцент санлы PCR (шулай ук TaqMan PCR дип тә атала, алга таба FQ-PCR дип атала) - 1995-нче елда АКШ-та PE (Перкин Элмер) тарафыннан эшләнгән яңа нуклеин кислотасы санлы технология. Бу технология гадәти PCR нигезендә флуоресцент маркалы зоналар өстәп ясала.Эластик PCR белән чагыштырганда, FQ-PCR аның санлы функциясен тормышка ашыру өчен күп өстенлекләргә ия.Бу мәкалә технологиянең үзенчәлекләрен, принципларын, ысулларын һәм кулланылышын кыскача сурәтләргә уйлый.
1 үзенчәлек
FQ-PCR гади PCRның югары сизгерлегенә ия түгел, ә флуоресцент зоналар куллану аркасында, фотоэлектр үткәрү системасы аша PCR көчәйтү вакытында флуоресцент сигналның үзгәрүен турыдан-туры ачыклый ала, бу санлы PCR күп җитешсезлекләрен җиңә, шуңа күрә ул ДНК гибридизациясенең югары үзенчәлегенә һәм спектроскопия технологиясенең югары төгәллегенә ия.
Мәсәлән, гомуми PCR продуктларын агароза гели электрофорезы һәм ультрафиолет нуры белән этиди бромид буяу яки полиакриламид гели электрофорезы һәм көмеш буяу белән күзәтергә кирәк.Моның өчен берничә корал гына кирәк түгел, ә вакыт һәм көч кирәк.Этидиум бромид кулланган таплар кеше организмы өчен зарарлы, һәм бу катлаулы эксперименталь процедуралар пычрану һәм ялган позитив мөмкинлекләр бирә.Ләкин, FQ-PCR үрнәк йөкләү вакытында капканы бер тапкыр гына ачарга тиеш, һәм алдагы процесс тулысынча ябык труба эше, бу PCR эшкәртү таләп итми, гадәти PCR операцияләрендә күп кимчелекләрдән саклана.Эксперимент гадәттә PE компаниясе тарафыннан эшләнгән ABI7100 PCR җылылык велосипедын куллана.
Прибор түбәндәге үзенчәлекләргә ия: id киң куллану: Аны ДНК һәм РНК PCR продуктларын санлаштыру, ген экспрессиясен тикшерү, патоген ачыклау һәм PCR шартларын оптимизацияләү өчен кулланырга мөмкин.Ique Уникаль сан принцибы: Флуоресцентлы маркалы пробалар кулланып, флюоресенция күләме лазер дулкынлануыннан соң PCR циклы белән җыелачак, шулай итеп санлаштыру максатына ирешәчәк.Working workingгары эш нәтиҗәлелеге: урнаштырылган 9600 PCR җылылык велосипедчысы, компьютер 1 һәм 2 сәгать контрольдә тотыла, 96 үрнәкне көчәйтү һәм санлаштыруны автоматик һәм синхрон рәвештә тәмамлау.Gel Гель электрофорезы кирәк түгел: ampleрнәкне эретергә һәм электрофорезга кирәк түгел, реакция трубасында турыдан-туры ачыклау өчен махсус тикшерү кулланыгыз.The Бору торбасында пычрану юк: уникаль тулы ябылган реакция трубасы һәм фотоэлектр үткәрү системасы кабул ителде, шуңа күрә пычрану турында борчыласы юк.- Нәтиҗә кабат чыгарыла: сан динамик диапазоны биш зурлыкка кадәр.Шуңа күрә, бу технология уңышлы эшләнгәнгә, ул күп фәнни тикшерүчеләр тарафыннан бәяләнде һәм күп өлкәләрдә кулланылды.
2 Принциплар һәм ысуллар
FQ-PCR эш принцибы - Так ферментының 5 ′ → 3 ′ экзонуклаз активлыгын куллану, PCR реакция системасына флуоресцентлы маркалы зонд өстәү.Прибор пример эзлеклелегендәге ДНК шаблоны белән махсус гибридлаштырыла ала.Зондның 5′end флуоресцент эмиссия гены FAM (6-карбоксифлуоресейн, флюоресенция эмиссиясенең иң югары ноктасы 518нм) белән язылган, һәм 3′end флуоресцентны сүндерү төркеме TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, флуоресцент эмиссиянең иң югары ноктасы 582nm), флуоресенция фосбины фосфоры.Зонд тотрыклы булып калгач, сүндергеч төркем чыгаручы төркемнең флуоресцент эмиссиясен баса.Чыгаручы төркем сүндерү төркеменнән аерылганнан соң, тыюлык күтәрелә, һәм оптик тыгызлык 518нм арта һәм флуоресцентны ачыклау системасы белән ачыклана. Ренатурация этабында зонд ДНК шаблоны белән гибридлаша, һәм киңәйтү этабындагы Так ферменты праймерны киңәйтү белән ДНК шаблоны буенча хәрәкәт итә.Зонд киселгәндә, сүндерү эффекты һәм флуоресцент сигнал чыга.Шаблон күчерелгән саен, флюоресцент сигнал чыгару белән бер зонаны кисәләр.Чыгарылган флорофорлар саны һәм PCR продуктлары саны арасында бер-берсенә бәйләнеш булганлыктан, бу ысул шаблонны төгәл бәяләү өчен кулланылырга мөмкин.Эксперименталь корал, гадәттә, PE компаниясе тарафыннан эшләнгән ABI7100 PCR җылылык велосипедын куллана, һәм башка җылылык велосипедчылары да кулланылырга мөмкин.Әгәр дә ABI7700 реакция тибындагы реакция системасы эксперимент өчен кулланылса, реакция тәмамлангач, сан нәтиҗәләре турыдан-туры компьютер анализы аша бирелергә мөмкин.Башка җылылык велосипедчыларын куллансагыз, RQ +, RQ-, △ RQ исәпләү өчен реакция трубасындагы флуоресцент сигналны үлчәү өчен флуоресцент детектор кулланырга кирәк.RQ + үрнәк трубаның флуоресцент эмиссия төркеменең люминесцент интенсивлыгын сүндерү төркеменең люминесцен интенсивлыгына күрсәтә, RQ- буш торбадагы икесенең нисбәтен күрсәтә, △ RQ (△ RQ = RQ + -RQ-) PCR эшкәртү вакытында флюоресенция сигналының үзгәрүен күрсәтә, мәгълүмат эшкәртелгәннән соң, сан нәтиҗәләре алына.Флуоресцент зоналар кертү аркасында, экспериментның үзенчәлеге сизелерлек яхшыра.Зондның дизайны, гадәттә, түбәндәге шартларга туры килергә тиеш: bindingБерүнең озынлыгы 20-40 нигез булырга тиеш.G GC базаларының эчтәлеге 40% белән 60% арасында, бер нуклеотид эзлеклелеген кабатламас өчен.Hy Гибридизациядән яки праймериз белән капланудан сакланыгыз.The Проб белән шаблон арасындагы бәйләнешнең тотрыклылыгы праймер белән шаблон арасындагы бәйләнешнең тотрыклылыгыннан зуррак, шуңа күрә тикшерүнең Tm бәясе праймерның Tm кыйммәтеннән ким дигәндә 5 ° C югарырак булырга тиеш.Моннан тыш, зонаның концентрациясе, зонд белән шаблон эзлеклелеге арасындагы гомология, һәм зонд белән праймер арасы эксперимент нәтиҗәләренә тәэсир итә.
Бәйләнешле продуктлар:
Китай Реаль Вакыт PCR Easyᵀᴹ-Такман җитештерүче һәм тәэмин итүче |Foregene (foreivd.com)
Пост вакыты: 15-2021 октябрь
