1. Төп белем (эксперименталь өлешне күрәсегез килсә, зинһар, икенче өлешкә күчегез)
Гадәттәге PCR-ның туемлы реакциясе буларак, Real Time PCR, нигездә, флюоресенция сигналының үзгәрүе аркасында, реаль вакытта PCR көчәйтү реакциясенең һәр циклында көчәйтү продукты күләменең үзгәрүен күзәтә, һәм башлангыч шаблонны ct бәясе һәм стандарт сызык арасындагы бәйләнеш аша анализлый.
ТР-PCR конкрет мәгълүматларынигез, флюоресенция бусагасыһәмCt кыйммәте.
| төп нигез: | 3-15-нче циклның флуоресцент бәясе - төп (төп), ул вакыт-вакыт үлчәү хатасы аркасында килеп чыга. |
| Бусага (бусага): | Көчләндерү кәкресенең экспоненциаль үсеш өлкәсендә тиешле позициядә куелган флуоресцентны ачыклау лимитына кагыла, гадәттә база стандарт тайпылышыннан 10 тапкыр. |
| КТ бәясе: | Бу һәр реакция трубасындагы флюоресенция бәясе бусагага җиткәч, PCR цикллары саны. Ct бәясе башлангыч шаблон күләменә капма-каршы пропорциональ. |
RT-PCR өчен гомуми маркировкалау ысуллары:
| ысулы | өстенлек | җитешсезлек | куллану күләме |
| SYBR GreenⅠ | Киң куллану, сизгер, арзан һәм уңайлы | Төп таләпләр югары, специаль булмаган полосаларга омтыла | Төрле максатлы геннарны санлы анализлау, ген экспрессиясен тикшерү, трансген рекомбинант хайваннар һәм үсемлекләр буенча тикшеренүләр өчен яраклы. |
| TaqMan | Яхшы үзенчәлек һәм югары кабатлау | Бәясе югары һәм конкрет максатлар өчен генә яраклы. | Патоген табу, наркотикларга каршы ген тикшерүе, наркотикларның эффективлыгын бәяләү, генетик авырулар диагнозы. |
| молекуляр маяк | Highгары үзенчәлек, флюоресенция, түбән фон | Бәясе югары, ул билгеле бер максат өчен генә яраклы, дизайны авыр, бәясе дә югары. | Конкрет ген анализы, SNP анализы |
2. Эксперименталь адымнар
2.1 Эксперименталь төркемләү турында- төркемдә берничә скважина булырга тиеш, һәм биологик кабатлау булырга тиеш.
| ① | Буш контроль | Экспериментларда күзәнәк үсешенең торышын ачыклау өчен кулланыла |
| ② | Тискәре контроль siRNA (специфик булмаган siRNA эзлеклелеге) | RNAi эшенең үзенчәлеген күрсәтегез.siRNA 200нМ концентрациясендә конкрет булмаган стресс реакциясен китерергә мөмкин. |
| ③ | Трансфекция реагент контроле | Күзәнәкләргә трансфекция реагентының токсиклылыгын яки максатлы генның чагылышына тәэсирен чыгарыгыз |
| ④ | максатлы генга каршы siRNA | Максатлы генның чагылышын җимерегез |
| ⑤ (өстәмә) | уңай siRNA | Эксперимент системасын һәм оператив проблемаларны чишү өчен кулланыла |
| ⑥ (өстәмә) | Флюоресцент контроль siRNA | Күзәнәк трансфекциясенең эффективлыгын микроскоп ярдәмендә күзәтергә мөмкин |
2.2 Праймер дизайн принциплары
| Күчерелгән фрагмент зурлыгы | Яхшырак 100-150bp |
| Праймер озынлыгы | 18-25б |
| GC эчтәлеге | 30% -70%, яхшырак 45% -55% |
| ТМ бәясе | 58-60 ℃ |
| Эзлек | Т / С өзлексез сакланыгыз;A / G өзлексез |
| 3 ахыр эзлеклелеге | GC бай яки AT байлардан сакланыгыз;терминал базасы яхшырак G яки C;Тдан саклану яхшырак |
| Тәмамлау | Праймер эчендә яки ике праймер арасында 3тән артык нигезнең тулыландырылган эзлеклелегеннән сакланыгыз |
| Specзенчәлек | Праймер үзенчәлеген раслау өчен шартлау эзләвен кулланыгыз |
ISiRNA төрләргә хас, һәм төрле төрләрнең эзлеклелеге төрле булачак.
ISiRNA туңдырылган кипкән порошокка салынган, ул бүлмә температурасында 2-4 атна тотрыклы саклана ала.
2.3 Алдан әзерләнергә тиеш кораллар яки реагентлар
| Праймер (эчке белешмәлек) | Шул исәптән алга һәм кире ике |
| Праймерлар (максатлы ген) | Шул исәптән алга һәм кире ике |
| Максатлы Si RNA (3 полоса) | Гадәттә, компания 3 полосаны синтезлый, аннары RT-PCR тарафыннан өчесенең берсен сайлый |
| Трансфекция комплекты | Lipo2000 һ.б. |
| РНК тиз чыгару комплекты | Трансфекциядән соң РНК алу өчен |
| Тиз кире транскрипция комплекты | cDNA синтезы өчен |
| PCR көчәйтү комплекты | 2 × Супер SYBR яшел qPCR Мастер Микс |
2.4 Конкрет эксперименталь адымнарда игътибар итергә кирәк булган сорауларга:
①siRNA трансфекция процессы
1. Пластинка өчен сез 24 кое тәлинкә, 12 кое тәлинкә яки 6 кое тәлинкә сайлый аласыз (24 скважинаның һәр коесында тәкъдим ителгән уртача РНК концентрациясе якынча 100-300 нг / ул), һәм күзәнәкләрнең оптималь трансфекция тыгызлыгы 60% -80% яки аннан да күбрәк.
2. Трансфекция адымнары һәм конкрет таләпләр инструкциягә туры килә.
3. Трансфекциядән соң үрнәкләр 24-72 сәгать эчендә mRNA ачыклау (RT-PCR) яки 48-96 сәгать эчендә белок табу өчен җыелырга мөмкин (WB)
② РНК алу процессы
1. Экзоген ферментлар белән пычрануны булдырмагыз.Бу, нигездә, битлекләр һәм перчаткалар киеп йөрүне үз эченә ала;стерилизацияләнгән пипетка киңәшләрен һәм EP трубаларын куллану;экспериментта кулланылган су RNase-Free булырга тиеш.
2. Тиз чыгару комплектында тәкъдим ителгәннән ике тапкыр эшләргә киңәш ителә, бу чыннан да чисталыкны һәм уңышны яхшыртачак.
3. Калдык сыеклыгы РНК баганасына кагылырга тиеш түгел.
③ РНК күләме
РНК чыгарылганнан соң, аны турыдан-туры Нанодроп белән бәяләргә мөмкин, һәм минималь уку 10нг / ул кадәр түбән булырга мөмкин.
- Транскрипция процессын карагыз
1. RT-qPCRның югары сизгерлеге аркасында, киләсе Ct артык булмаска яки статистик анализ өчен SD артык зур булмасын өчен, һәр үрнәк өчен ким дигәндә 3 параллель скважина ясалырга тиеш.
2. Мастер катнашмасын кат-кат туңдырмагыз.
3. Eachәр труба / тишекне яңа оч белән алыштырырга кирәк!Samрнәкләр өстәр өчен бер үк пипетка очын өзлексез кулланмагыз!
4. ampleрнәк өстәгәннән соң 96 кое тәлинкәгә бәйләнгән фильм тәлинкә белән тигезләнергә тиеш.Машинага куйганчы центрифуга ясау яхшырак, труба стенасындагы сыеклык агып төшә һәм һава күбекләрен бетерә ала.
- Гадәттәге сызык анализы
| Логарифмик үсеш чоры юк | Шаблонның югары концентрациясе |
| КТ бәясе юк | Флуоресцент сигналларны табу өчен дөрес булмаган адымнар; праймерларның яки зоналарның деградациясе - аның бөтенлеген PAGE электрофорезы белән ачыкларга мөмкин; шаблонның җитәрлек күләме; шаблоннарның деградациясе - пычраклар кертүдән һәм үрнәк әзерләүдә кат-кат туңдырудан һәм эрүдән саклану; |
| Ct> 38 | Түбән көчәйтү эффективлыгы;PCR продукты бик озын;төрле реакция компонентлары бозыла |
| Сызыклы көчәйтү сызыгы | Тикшеренүләр кат-кат туңдыру цикллары яки яктылыкка озак тәэсир итү аркасында өлешчә бозылырга мөмкин |
| Күп кабатланган тишекләрнең аермасы аеруча зур | Реакция эремәсе бөтенләй эреп бетми яки реакция эремәсе катнашмый;PCR коралының җылылык мунчасы флуоресцент матдәләр белән пычранган |
2.5 Мәгълүмат анализы турында
QPCR мәгълүмат анализын чагыштырмача санлаштыруга һәм абсолют санлаштыруга бүлеп була.Мәсәлән, контроль төркемдәге күзәнәкләр белән чагыштырганда, дәвалау төркемендәге күзәнәкләр,
X генның mRNA ничә тапкыр үзгәрә, бу чагыштырмача сан;билгеле сандагы күзәнәкләрдә, X генның mRNA
Күпме күчермә бар, бу абсолют санлаштыру.Гадәттә без лабораториядә иң күп кулланган нәрсә - чагыштырма сан ысулы.Гадәттә,2-ΔΔct ысулыэкспериментларда иң күп кулланыла, шуңа күрә монда бу ысул гына җентекләп кертеләчәк.
2-ΔΔct ысулы: Алынган нәтиҗә - эксперимент төркемендәге максатлы генның контроль төркемдәге максатлы ген белән чагыштырганда аермасы.Максатлы генның да, эчке белешмә генның көчәйтү эффективлыгы 100% ка якын булырга тиеш, һәм чагыштырмача тайпылыш 5% тан артмаска тиеш.
Хисаплау ысулы түбәндәгечә:
Controlct контроль төркеме = контроль төркемдәге максатлы генның ct бәясе - контроль төркемдәге эчке белешмә генның ct бәясе
Δct эксперимент төркеме = эксперимент төркемендәге максатлы генның ct кыйммәте - эксперимент төркемендәге эчке белешмә генның ct кыйммәте
ΔΔct = Δct эксперименталь төркем-Δct контроль төркеме
Ниһаять, белдерү дәрәҗәсендәге аерманың күплеген исәпләгез:
Катламны үзгәртү = 2-ΔΔct (Excel функциясенә туры килә POWER)
Бәйләнешле продуктлар:
Күзәнәк туры RT-qPCR комплекты
Пост вакыты: 20-2023 май
