Ⅰ. Реакция системасының сизгерлеген арттыру:
1. Аерым югары квалификацияле РНК:
Уңышлы cDNA синтезы югары квалификацияле РНКдан килә.Qгары квалификацияле РНК ким дигәндә гомуми озынлыкны тәэмин итәргә тиеш, һәм EDTA яки SDS кебек язу ферментлары булмаган ингибиторлар юк.РНКның сыйфаты сез cDNAга күчерә алырлык эзлеклелек мәгълүматының максималь кыйммәтен билгели.Гомуми РНК чистарту ысулы - изоцянат / ассидофенол куллануның адым ысулы.RNase пычрануына юл куймас өчен, RNase бай үрнәкләрдән аерылган РНК (ашказаны асты бизе кебек) югары сыйфатлы РНКны саклап калу өчен формальдегид саклауны таләп итә, бу озак вакыт саклау өчен тагын да күбрәк.Кычыткан бавырыннан алынган РНК, нигездә, бер атна суда сакланганнан соң деградацияләнде, ә тычкан ботыгыннан алынган РНК өч ел суда сакланганнан соң тотрыклы булып калды.Моннан тыш, 4кбдан зуррак транскрипцияләр, кечкенә транскрипцияләргә караганда, RNase деградациясен эзләүгә сизгеррәк.Саклаучы РНК үрнәгенең тотрыклылыгын арттыру өчен, РНК ион металминасында эреп, -70 ° C саклана.РНКны саклау өчен кулланылган тилид РНКны киметүче төрле әйбер булырга тиеш түгел.Без ашказаны асты бизеннән алынган РНК металмаминда ким дигәндә бер ел сакланырга мөмкин.РНК кулланырга әзер булгач, сез РНКны яудыру өчен түбәндәге ысулларны куллана аласыз: NaCl-ны 0,2 м һәм этанол күләменнән 4 тапкыр өстәргә, бүлмә температурасын 3-5 минутка урнаштырыгыз, һәм 5 минут эчендә 10,000 × г центрифуга.
2. Кире транскриптазны RNaseH активлыгысыз кулланыгыз (RNaseH-) ：
CDNA синтезының озынлыгын һәм уңышын арттыру өчен, кире транскрипция реакцияләренә RNase ингибиторлары еш өстәлә.RNase ингибиторы буферлар булганда һәм DTT кебек агентларны киметүче беренче чылбыр синтезы реакциясенә өстәлә, чөнки CDNA алдыннан синтез процессы ингибиторны күрсәтә, шуның белән РНКны киметүче бәйләнгән RNases чыгара.Протеин RNase ингибиторы RNase A, B, C тарафыннан бозылудан саклый, һәм тиредәге RNasesны булдырмый, шуңа күрә бу ингибиторларны куллануга карамастан, бармаклардан RNases кертмәскә кирәк.
Кире транскриптаз РНКны CDNAга әйләндерүне катализацияли.M-MLV һәм AMV икесе дә үз полимераз активлыгына өстәп, эндоген RNaseH активлыгына ия.RNaseH эшчәнлеге РНК шаблоннары һәм ДНК праймерлары яки CDNA киңәйтү полосалары арасында формалашкан гетерозигоз полосалар өчен полимераз активлыгы белән көндәшлек итә, һәм РНКны киметә: РНК полосалары ДНК комплексларында.RNaseH эшчәнлеге белән бозылган РНК шаблоннары cDNA синтезы өчен эффектив субстратлар булып кулланылмый, cDNA синтезының уңышын һәм озынлыгын киметә.Шулай итеп, кире транскриптазның RNaseH эшчәнлеген бетерү яки киметү зур файда китерәчәк.
SuperScriptⅡ кире транскриптаз, MMLV кире транскриптаз - һәм термоСкрипт кире транскриптаз, RNaseH AMV - MMLV һәм AMV белән чагыштырганда тулы озынлыктагы CDNA китерде.RT-PCR сизгерлеге синтезланган cDNA күләменә тәэсир итә.ThermoScript AMV белән чагыштырганда күпкә сизгер.RT-PCR продуктларының күләме кире транскриптазның CDNA синтезлау мөмкинлеге белән чикләнә, аеруча зуррак Cdnas клонлаштырганда.MMLV белән чагыштырганда, SuperScripⅡ озын RT-PCR продуктларының уңышын сизелерлек арттырды.RNaseH-нең кире транскриптасы җылылык тотрыклылыгын арттыра, шуңа күрә реакция 37-42 normal нормадан югарырак температурада башкарылырга мөмкин.Тәкъдим ителгән синтез шартларында олиго (dT) праймериз һәм 10μCi [альфа-р] dCTP кулланылды.Беренче чылбырның гомуми производствосы TCA явым-төшем ысулы ярдәмендә исәпләнде.Тулы озынлыктагы cDNA зурлыктагы сортлы полосаны чыгару һәм эшкәртүле агароза гелендә санау ярдәмендә анализланды.
3. Кире транскрипциянең җылылык саклау температурасын арттыру ：
Holdingгары тоту температурасы РНКның икенчел структурасын ачарга һәм реакциянең уңышын арттырырга ярдәм итә.Күпчелек РНК шаблоннары өчен, РНК һәм праймерны 65 ° C температурада буфер яки тозсыз тотып, аннары бозда тиз суыту күпчелек икенчел структураларны юкка чыгара һәм праймерларны бәйләргә мөмкинлек бирә.Ләкин, кайбер шаблоннар җылылык денатурасыннан соң да икенчел структурага ия.Бу катлаулы шаблоннарны көчәйтү ThermoScript кире транскриптаз ярдәмендә һәм кире транскриптаз реакциясен көчәйтүне яхшырту өчен югары температурада урнаштырып башкарырга мөмкин.Holdingгары температура шулай ук үзенчәлекне арттырырга мөмкин, аеруча cDNA синтезы генга хас праймериз (GSPS) ярдәмендә башкарылганда (3 бүлекне карагыз).GSP куллансагыз, праймерның Tm бәясе көтелгән температура белән бертигез булуына инаныгыз.Олиго (dT) һәм 60 prim өстендә очраклы праймериз кулланмагыз.60 to кадәр күтәрелгәнче очраклы праймериз 25 at 10 минутта үткәрелергә тиеш.Higherгары кире транскрипция температурасын куллану белән беррәттән, спецификацияне РНК / пример катнашмасын 65 ℃ денатурация температурасыннан кире транскрипция температурасына күчереп һәм җылытылган 2 × реакция катнашмасын (CDNA җылылык инициативасы синтезы) өстәп яхшыртырга мөмкин.Бу ысул түбән температурада булган интермолекуляр баз парлашуны булдырмаска ярдәм итә.PCR коралын куллану RT-PCR өчен кирәк булган күп температураны ачкычларны гадиләштерә.
Өченче җылылык тотрыклыланган полимераз Mg2 + һәм Mn2 + булганда РНК полимеразы булганда ДНК полимеразы ролен башкара.Ул 65 up кадәр җылылык тота ала.Ләкин, PCR вакытында Mn2 + булуы тугрылыкны киметә, бу TD полимеразын югары төгәл көчәйтү өчен яраксыз итә, мәсәлән, cDNA клонлау.Моннан тыш, T кире транскрипциядә азрак эффектив, бу сизгерлекне киметә, һәм бер фермент кире транскрипция һәм PCR ясый алганга, кире транскрипциясез контроль реакцияләр CDNA көчәйтелгән продуктларын пычратылган геном ДНК продуктларын аеру өчен кулланылмый.
4. Кире транскрипциягә ярдәм итүче өстәмә ：
Беренче чылбыр синтезы реакциясенә глицерин һәм DMSO кебек өстәмәләр кушылу нуклеин кислотасының тотрыклылыгын киметергә һәм РНК икенчел структурасын ачарга мөмкин.SuperScriptⅡ яки MMLV эшчәнлегенә тәэсир итмичә 20% га кадәр глицерин яки 10% DMSO өстәргә мөмкин.AMV шулай ук активлыкны киметмичә 20% га кадәр глицеролга түзә ала.SuperScriptⅡ кире транскрипция реакциясендә RT-PCR сизгерлеген арттыру өчен, 10% глицерол кушылып, 45 at изоляцияләнергә мөмкин.Әгәр ретротранскрипция-реакция продуктының 1/10 өлеше PCRга кушылса, көчәйтү реакциясендә глицерол концентрациясе 0,4% тәшкил итә, бу PCR-ны тыю өчен җитми.
5. RNaseH эшкәртү ：
PCR алдыннан CDase синтез реакцияләрен RNaseH белән дәвалау ярдәмендә сизгерлекне яхшыртырга мөмкин.Кайбер шаблоннар өчен, CDNA синтез реакциясендәге РНК көчәйтелгән продуктларны бәйләргә комачаулый, бу очракта RNaseH дәвалау сизгерлекне арттырырга мөмкин.Гадәттә, RNaseH белән эшкәртү чагыштырмача озын озынлыктагы CDNA максат шаблонын көчәйтү өчен кирәк, мәсәлән, аз күчермәле тубер шерозы.Бу катлаулы шаблон өчен, RNaseH SuperScriptⅡ яки AMV синтезланган cDNA сигналын көчәйтте.Күпчелек RT-PCR реакцияләре өчен, RNaseH белән эшкәртү факультатив, чөнки 95 ℃ изоляцияләнгән PCR денатурация ады гадәттә РНКдан РНКны гидролизацияли: ДНК комплексы.
6. РНКның аз күләмен ачыклау өчен камилләштерелгән ысуллар ：
РТ-PCR аз күләмдә РНК булганда аеруча авыр.РНКны аеру вакытында гликогенны йөртүче буларак өстәү кечкенә үрнәкләрнең уңышын арттырырга ярдәм итә.Тризол белән бер үк вакытта RNaseсыз гликоген өстәргә мөмкин.Гликоген суда эри һәм соңрак явым-төшемдә булышу өчен РНК белән су фазасында кала ала.РНазсыз гликогенның тәкъдим ителгән концентрациясе 50мгдан аз тукымалар яки 106 культуралы күзәнәкләр өчен 250μg / мл.
SuperScriptⅡ ярдәмендә транскрипция реакцияләренә кире ацетилатланган BSA кушылуы сизгерлекне арттырырга мөмкин, һәм аз күләмле РНК өчен, SuperScriptⅡ күләмен киметергә һәм 40 берәмлек RnaseOut нуклеаз ингибиторы өстәп, ачыклау дәрәҗәсен яхшырта ала.Әгәр дә гликоген РНК аеруда кулланылса, SuperScriptⅡ ярдәмендә транскрипция реакцияләрен кире кайтару өчен BSA яки RNase ингибиторларын өстәргә киңәш ителә.
Ⅱ. RT-PCR үзенчәлеген арттыру
1. cNDA синтезы ：
Беренче катлы CDNA синтезын башлау өчен өч төрле ысул кулланылырга мөмкин, һәм һәр ысулның чагыштырма үзенчәлеге синтезланган cDNA күләменә һәм төренә тәэсир итә.
Очраклы праймериз ысулы - өч ысулның иң кечкенәсе.Праймерлар кыска, өлешчә озынлыктагы cDNA чыгару өчен транскрипция буенча берничә сайтта ябыштырыла.Бу ысул еш кына 5 ′ терминал эзлеклелеген һәм РНК шаблоннарыннан икенчел структур регионнар белән яки кире транскриптаз кабатлый алмаган сайтларны алу өчен кулланыла.Иң озын CDNA алу өчен, һәр РНК үрнәгендә праймерларның РНК белән чагыштырмасы эмпирик рәвештә билгеле булырга тиеш.Очраклы праймерларның башлангыч концентрациясе 20μл реакция системасына 50 дән 250нгга кадәр.Гомуми РНКдан очраклы праймериз ярдәмендә синтезланган CDNA нигездә рибосомаль РНК булганга, шаблон буларак поли (А) + РНК сайлана.
Олиго (dT) инициативасы очраклы праймерларга караганда конкретрак.Күпчелек эукариотик күзәнәкләрдә mRNAның 3 ′ очында табылган поли (A) койрыгы белән гибридлаша.Поли (А) + РНК гомуми РНКның якынча 1% - 2% булганлыктан, cDNA күләме һәм катлаулылыгы очраклы праймериз кулланылганга караганда күпкә азрак.Highгары спецификасы булганлыктан, олиго (dT), гадәттә, РНКның пример коэффициенты һәм поли (A) + сайлау өчен оптимизация таләп итми.20μл реакция системасына 0,5μг олиго (dT) кулланырга киңәш ителә.олиго (dT) 12-18 күпчелек RT-PCR өчен яраклы.ThermoScript RT-PCR системасы олиго (dT) 20 тәэмин итә, яхшы җылылык тотрыклылыгы аркасында һәм югары температура өчен яраклы.
Ген специфик праймериз (GSP) - кире транскрипция адымы өчен иң яхшы конкрет праймериз.GSP - антисенс олигонуклеозид, ул РНА эзлеклелеге белән гибридлаша ала, очраклы праймер яки олиго (dT) кебек барлык Рналарны яндыру урынына.PCR праймерларын проектлау өчен кулланылган кагыйдәләр кире транскрипция реакциясе GSP дизайнына да кагыла.GSP mRNA3 ′ ахырында көчәйтелгән пример белән бер үк эзлеклелектә булырга мөмкин, яки GSP кире көчәйтү праймеры белән аска агымга ясалырга мөмкин.Кайбер көчәйтелгән объектлар өчен уңышлы RT-PCR өчен бердән артык антисенс праймер эшләргә кирәк, чөнки максатчан РНКның икенчел структурасы праймерны бәйләргә комачаулый ала.20 чылбырның беренче синтез реакция системасында 1pmol антисенс GSP кулланырга тәкъдим ителә.
2. Кире транскрипциянең җылылык саклау температурасын арттыру ：
GSP спецификасыннан тулысынча файдалану өчен, югары җылылык тотрыклылыгы булган кире транскриптаз кулланылырга тиеш.Reactionылылык тотрыклы кире транскриптаз реакция катгыйлыгын арттыру өчен югары температурада изоляцияләнергә мөмкин.Мәсәлән, әгәр GSP 55 ° C белән яндырылса, GSP спецификасы тулысынча кулланылмый, кире транскрипция 37 ° C температурада AMV яки M-MLV ярдәмендә түбән катгыйлык белән башкарылса.Ләкин, SuperScripⅡ һәм ThermoScript 50 ℃ яки югарырак реакциядә булырга мөмкин, бу түбән температурада җитештерелгән билгеле булмаган продуктларны бетерә.Максималь үзенчәлек өчен, РНК / праймер катнашмасы турыдан-туры 65 ℃ денатурация температурасыннан кире транскрипция тоту температурасына күчерелгән 2 х реакция катнашмасы (CDNA синтезының җылылык инициативасы) кушылып күчерелергә мөмкин.Бу түбән температурада молекулалар арасында төп парлашуны булдырмаска ярдәм итә.PCR коралын куллану RT-PCR өчен кирәк булган күп температура күчүне гадиләштерә.
3. Геном ДНК пычрануны киметү ：
RT-PCR белән бер потенциаль кыенлык - РНК геном ДНКны пычрату.Тризол реагенты кебек яхшырак РНК аеру ысулларын куллану, РНК препаратларында геном ДНК пычрануны киметә.Геном ДНКдан җитештерелгән продуктлардан саклану өчен, РНКны DnasⅠ көчәйтү дәрәҗәсе белән эшкәртеп була, кире транскрипциягә кадәр пычратылган ДНКны чыгару өчен.DNaseⅠ ашкайнатуны туктату өчен, үрнәкләр 2,0ММ EDTAда 65 at 10 минутта сакланган.EDTA югары температурада булган магний ионына бәйле РНК гидролизын булдырмас өчен магний ионнарын шелатлый.
Күчерелгән cDNAны геном ДНК көчәйтү продуктыннан аеру өчен, аерылган экзон белән аерым анналь ясалган праймерлар эшләнергә мөмкин.CDNAдан алынган PCR продуктлары пычратылган геном ДНКдан алынганнан кыска булачак.Кире транскрипциясез контроль эксперимент шулай ук һәр РНК шаблонында бирелгән фрагментның геном ДНК яки CDNAдан булуын ачыклау өчен үткәрелә.Кире транскрипция булмаганда алынган PCR продуктлары геномнан алынган.
Бәйләнешле продукт
- Бер адымлы комплект кире транскрипцияне һәм PCRны бер трубада башкарырга мөмкинлек бирә.Аңа RNA шаблоны, махсус PCR праймерлары һәм RNase-Free ddH өстәргә кирәк2O.
- РНКның реаль-санлы анализы тиз һәм төгәл үткәрелергә мөмкин.
- Комплект уникаль Foregene кире транскрипция реагентын һәм Foregene HotStar Taq DNA полимеразын куллана, реакциянең көчәйтү эффективлыгын һәм үзенчәлеген эффектив яхшырту өчен уникаль реакция системасы белән берләштерелгән.
- Оптимальләштерелгән реакция системасы реакцияне ачыклау сизгерлегенә, җылылык тотрыклылыгына һәм яхшырак толерантлыкка китерә.
- 2 минут эчендә шаблондагы gDNAны бетерә алган gDNAны бетерү өчен эффектив сәләт.
- Эффектив кире транскрипция системасы, беренче CDNA синтезын тәмамлау өчен 15 минут вакыт кирәк.
- Катлаулы шаблоннар: югары GC эчтәлеге булган шаблоннар һәм катлаулы икенчел структурасы да югары эффективлык белән кире кайтарылырга мөмкин.
-Гары сизгерлек кире транскрипция системасы, pg дәрәҗәсендәге шаблоннар шулай ук югары сыйфатлы CDNA ала ала.
- Кире транскрипция системасы югары җылылык тотрыклылыгына, оптималь реакция температурасы 42 and, һәм ул әле 50 at тә яхшы кире транскрипция күрсәткечләренә ия.
Пост вакыты: март-07-2023
