一 reaction реакция системасының сизгерлеген арттыру ：

1. qualityгары сыйфатлы РНКны изоляцияләү ：

Уңышлы cDNA синтезы югары сыйфатлы РНКдан килә.Qгары сыйфатлы РНК ким дигәндә тулы озынлыкта булырга һәм EDTA яки SDS кебек кире транскриптаз ингибиторыннан азат булырга тиеш.РНКның сыйфаты сез cDNAга транскрипцияләнә алырлык максималь күләмне билгели.Гомуми РНКны чистарту ысулы - гуанидин изотиокянат / кислота фенолын кулланып бер этаплы ысул.RNase күләмендә пычрануны булдырмас өчен, RNase бай үрнәкләрдән изоляцияләнгән РНК (ашказаны асты бизе кебек) югары сыйфатлы РНКны саклау өчен, аеруча озак вакытлы саклау өчен, формальдегидта сакланырга тиеш.Кычыткан бавырыннан алынган РНК бер атна суда сакланганнан соң деградацияләнә, ә тычкан ботыгыннан алынган РНК 3 ел суда сакланганнан соң тотрыклы булып кала.Моннан тыш, 4 кбдан озынрак транскрипцияләр, кечкенә транскрипцияләргә караганда, RNases эзе белән деградациягә сизгеррәк.Сакланган РНК үрнәкләренең тотрыклылыгын арттыру өчен, РНК деонизацияләнгән формамидта эреп, -70 ° C сакланырга мөмкин.РНКны саклау өчен кулланылган формамид РНКны бозучы чүпләрдән азат булырга тиеш.Без ашказаны асты бизеннән РНК ким дигәндә бер ел формамидта сакланырга мөмкин.РНК кулланырга әзерләнгәндә, сез РНКны яудыру өчен түбәндәге ысулны куллана аласыз: NaCl-ны 0,2М һәм этанол күләменнән 4 тапкыр өстәргә, бүлмә температурасында 3-5 минутка, 5 минут эчендә центрифуга 10,000 × г.

2. RNaseH-актив булмаган (RNaseH-) кире транскриптаз кулланыгыз ：

CDNA синтезының озынлыгын һәм уңышын арттыру өчен, кире транскрипция реакцияләренә RNase ингибиторлары еш өстәлә.Беренче катлы синтез реакциясе вакытында буфер һәм киметүче агент (мәсәлән, DTT) булганда RNase ингибиторлары кушылырга тиеш, чөнки CDNA синтезына кадәр булган процесс ингибиторны денатурацияли, шуның белән РНКны боза ала торган бәйләнгән RNase җибәрә.Протеин RNase ингибиторы RNase A, B, C белән РНКның деградациясен булдырмый, һәм тиредәге RNase-ны булдырмый, шуңа күрә бу ингибиторларны куллануга карамастан, бармакларыгыздан RNase кертмәгез.

Кире транскриптаз РНКның cDNA конверсиясен катализацияли.M-MLV һәм AMV икесе дә үз полимераз активлыгына өстәп, эндоген RNaseH активлыгына ия.RNaseH эшчәнлеге һәм полимераз активлыгы РНК шаблоны белән ДНК праймеры яки cDNA киңәйтү полосасы арасында формалашкан гибрид полоса өчен бер-берсе белән көндәшлек итә, һәм РНК полосасын РНКдагы деградацияли: ДНК комплексы.RNaseH эшчәнлеге белән бозылган РНК шаблоны cDNA синтезы өчен эффектив субстрат булып хезмәт итә алмый, бу cDNA синтезының уңышын һәм озынлыгын киметә.Шуңа күрә, кире транскриптазның RNaseH эшчәнлеген бетерү яки киметү файдалы булыр .。

SuperScript Ⅱ кире транскриптаз, RNaseH- MMLV кире транскриптаз һәм термоСкрипт кире транскриптаз, RNaseH- AMV, MMLV һәм AMV белән чагыштырганда күбрәк һәм тулы озынлыктагы CDNA ала ала.RT-PCR сизгерлеге cDNA синтезы күләменә тәэсир итәчәк.ThermoScript AMV белән чагыштырганда күпкә сизгер.RT-PCR продуктларының күләме кире транскриптазның CDNA синтезлау мөмкинлеге белән чикләнә, аеруча зуррак CDNAларны клонлаганда.MMLV белән чагыштырганда, SuperScripⅡ озын RT-PCR продуктларының уңышын сизелерлек арттырды.RNaseH-кире транскриптаз шулай ук ​​термостиллылыкны арттырды, шуңа күрә реакция гадәти 37-42 ° C-тан югарырак температурада башкарылырга мөмкин.Тәкъдим ителгән синтез шартларында олиго (dT) праймерын һәм 10 μCi [α-P] dCTP кулланыгыз.Беренче юлның гомуми уңышы TCA явым-төшем ысулы ярдәмендә исәпләнде.Тулы озынлыктагы CDNA анализланган һәм эшкәртүле агароза геленә саналган зурлыктагы сортлар ярдәмендә анализланган.

3. Кире транскрипция өчен инкубация температурасын күтәрегез ：

Higherгары инкубация температурасы РНКның икенчел структурасын ачарга ярдәм итә, реакциянең уңышын арттыра.Күпчелек РНК шаблоннары өчен, РНК һәм праймерларны 65 ° C температурада буфер яки тозсыз инкубацияләү, аннары бозда тиз суыту күпчелек икенчел структураларны бетерәчәк һәм праймерларны бәйләргә мөмкинлек бирәчәк.Ләкин, кайбер шаблоннар җылылык денатурасыннан соң да икенчел структураларга ия.Бу катлаулы шаблоннарны көчәйтү ThermoScript Кире Транскриптаз ярдәмендә һәм кире транскрипция реакциясен көчәйтүне яхшырту өчен югары температурада урнаштыру белән башкарылырга мөмкин.Incгары инкубация температурасы үзенчәлекне арттырырга мөмкин, аеруча ген специфик примерлар (GSP) cDNA синтезы өчен кулланылганда (3 бүлекне кара).GSP куллансагыз, праймеризның Tm көтелгән инкубация температурасы белән бертигез булуына инаныгыз.Олиго (dT) һәм 60 ° C-тан очраклы праймериз кулланмагыз.Очраклы праймериз 60 ° C ка кадәр 10 минут эчендә 25 ° C инкубация таләп итә.Кире транскрипция температурасын куллану белән беррәттән, РНК / пример катнашмасын турыдан-туры 65 ° C денатурация температурасыннан кире транскрипция инкубация температурасына күчереп һәм җылытылган 2 × реакция катнашмасын (CDNA кайнар старт синтезы) өстәп яхшыртырга мөмкин.Бу ысул түбән температурада булган интермолекуляр баз парлашуны булдырмаска ярдәм итә.RT-PCR өчен кирәк булган берничә температураны күчү җылылык велосипедын кулланып гадиләштерелергә мөмкин.

Өченче термостил полимераз Mg2 + булганда һәм Mn2 + булганда РНК полимерасы ролен башкара.Аны максималь 65 ° C температурада җылы сакларга мөмкин.Ләкин, PCR вакытында Mn2 + булуы тугрылыкны киметә, бу T-полимеразны югары төгәл көчәйтү өчен яраксыз итә, мәсәлән, cDNA клонлау.Моннан тыш, Tth түбән кире транскрипция эффективлыгына ия, бу сизгерлекне киметә, һәм кире транскрипция һәм PCR бер фермент белән башкарылырга мөмкин булганлыктан, кире транскрипциясез контроль реакцияләр cDNA көчәйтү продуктларын геном ДНК белән чагыштыру өчен кулланылмый.Көчәйтү продуктлары аерылды.

4. Кире транскрипциягә ярдәм итүче өстәмәләр ：

Беренче катлы синтез реакциясенә глицерол һәм DMSO кебек өстәмәләр өстәлә, алар нуклеин кислотасының тотрыклылыгын киметә һәм РНКның икенчел структурасын чишә ала.SuperScript II яки MMLV эшчәнлегенә тәэсир итмичә 20% га кадәр глицерол яки 10% DMSO өстәргә мөмкин.AMV шулай ук ​​20% га кадәр глицеролга активлыкны югалтмыйча түзә ала.SuperScriptⅡ кире транскрипция реакциясендә RT-PCR сизгерлеген арттыру өчен, 10% глицерол кушылырга һәм 45 ° C инкубацияләнергә мөмкин.Әгәр кире транскрипция реакция продуктының 1/10 өлеше PCRга кушылса, көчәйтү реакциясендә глицерол концентрациясе 0,4% тәшкил итә, бу PCR-ны тыю өчен җитми.

5. RNaseH дәвалау ：

PCR алдыннан CDase синтез реакцияләрен дәвалау RNaseH белән сизгерлекне арттырырга мөмкин.Кайбер шаблоннар өчен, CDNA синтез реакциясендә РНК көчәйтү продуктларын бәйләргә комачаулый, бу очракта RNaseH дәвалау сизгерлекне арттырырга мөмкин.Гадәттә, озын озынлыктагы CDNA максат шаблоннарын көчәйткәндә, RNaseH белән эшкәртү кирәк, мәсәлән, аз күчерелгән тубер шероз II.Бу катлаулы шаблон өчен, RNaseH дәвалау SuperScript II яки AMV-синтезланган cDNA җитештергән сигналны көчәйтте.Күпчелек RT-PCR реакцияләре өчен, RNaseH белән эшкәртү факультатив, чөнки 95 ° C температурада PCR денатурация адымы гадәттә РНКдагы РНКны гидролизацияли: ДНК комплексы.

6. Кечкенә РНКны ачыклау ысулын камилләштерү ：

РТ-PCR аз күләмдә РНК булганда аеруча авыр.РНК изоляциясе вакытында ташучы буларак өстәлгән гликоген кечкенә үрнәкләрнең уңышын арттырырга ярдәм итә.Тризол өстәү белән бер үк вакытта RNaseсыз гликоген өстәргә мөмкин.Гликоген суда эри һәм соңрак явым-төшемгә булышу өчен РНК белән су фазасында саклана ала.50 мг тукымалардан яки 106 культуралы күзәнәкләрдән алынган үрнәкләр өчен, RNaseсыз гликогенның тәкъдим ителгән концентрациясе 250 μг / мл.

SuperScript II ярдәмендә кире транскрипция реакциясенә ацетилатланган BSA өстәү сизгерлекне арттырырга мөмкин, һәм аз күләмле РНК өчен, SuperScript II күләмен киметергә һәм 40 берәмлек RNaseOut нуклеаз ингибиторы өстәп, ачыклау дәрәҗәсен күтәрә ала.Әгәр дә гликоген РНК изоляция процессында кулланылса, кире транскрипция реакциясе өчен SuperScript II кулланганда әле BSA яки RNase ингибиторы өстәргә киңәш ителә.

RT RT RT-PCR үзенчәлеген арттыру

1. CND асинтезы ：

Беренче катлы CDNA синтезы өч төрле ысул ярдәмендә башланырга мөмкин, аларның чагыштырмача үзенчәлеге синтезланган CDNA күләменә һәм төренә тәэсир итә.

Очраклы праймериз ысулы өч ысулның иң кечкенәсе иде.Праймерлар транскрипция буенча берничә сайтта анналь, кыска, өлешчә озынлыктагы CDNAлар ясыйлар.Бу ысул еш 5 ′ ахыр эзлеклелеген алу һәм икенчел структура өлкәләре булган РНК шаблоннарыннан яки кире транскриптаз белән күчереп булмый торган бетү урыннары белән CDNA алу өчен еш кулланыла.Иң озын CDNA алу өчен, һәр РНК үрнәгендә праймерларның РНК белән чагыштырмасы эмпирик рәвештә билгеле булырга тиеш.Очраклы праймерларның башлангыч концентрациясе 20 реакциягә 50 дән 250 нгга кадәр.CDNA очраклы праймериз ярдәмендә гомуми РНКдан синтезланганлыктан, беренче чиратта рибосомаль РНК булганлыктан, поли (A) + РНК шаблон итеп сайлана.

Олиго (dT) праймерлары очраклы праймерларга караганда конкретрак.Күпчелек эукариотик mRNA-ның 3 ′ очында табылган поли (А) койрыгына гибридлаша.Поли (А) + РНК гомуми РНКның якынча 1% - 2% булганлыктан, cDNA күләме һәм катлаулылыгы очраклы праймерларга караганда күпкә азрак.Highгары спецификасы булганлыктан, олиго (dT) гадәттә РНКның праймерларга һәм поли (A) + сайлау оптимизациясен таләп итми.20μл реакция системасына 0,5μг олиго (dT) кулланырга киңәш ителә.олиго (dT) 12-18 күпчелек RT-PCR өчен яраклы.ThermoScript RT-PCR системасы олиго (dT) 20 тәкъдим итә, чөнки югары инкубация температурасы өчен җылылык тотрыклылыгы яхшырак.

Ген конкрет праймериз (GSP) - кире транскрипция адымы өчен иң конкрет праймериз.GSP - антисенс олигонуклеотид, ул РНК максатлы эзлеклелектә гибридлаша ала, очраклы праймерлардан яки олигодан (dT) аермалы буларак, барлык РНКларга анналь.PCR праймерларын проектлау өчен кулланылган шул ук кагыйдәләр кире транскрипция реакцияләрендә GSP дизайнына кагыла.GSP көчәйтү примеры белән бер үк эзлеклелектә булырга мөмкин, ул mRNA-ның 3 ′ иң очына кадәр ябыштырыла, яки GSP кире көчәйтү примерының аскы агымына ясалырга мөмкин.Кайбер көчәйтелгән предметлар өчен, бердән артык антисенс праймер уңышлы RT-PCR өчен эшләнергә тиеш, чөнки максатчан РНКның икенчел структурасы пример бәйләнешен булдырмаска мөмкин.20 мм беренче катлы синтез реакциясендә 1 pmol антисенс GSP кулланырга киңәш ителә.

2. Кире транскрипция өчен инкубация температурасын күтәрегез ：

GSP спецификасының тулы өстенлегеннән тулысынча файдалану өчен, югары термостаблылыгы булган кире транскриптаз кулланылырга тиеш.Термостable кире транскриптазлар реакция катылыгын арттыру өчен югары температурада инкубацияләнергә мөмкин.Мисал өчен, 55 ° C температурада GSP аннальлары булса, AMV яки M-MLV 37 ° C түбән катлы кире транскрипция өчен кулланылса, GSP үзенчәлеге тулысынча кулланылмаячак.Ләкин, SuperScript II һәм ThermoScript 50 ° C яки югарырак реакциядә булырга мөмкин, бу түбән температурада барлыкка килгән продуктларны бетерәчәк.Максималь үзенчәлек өчен, РНК / праймер катнашмасы турыдан-туры 65 ° C денатурация температурасыннан кире транскрипция инкубация температурасына күчерелергә һәм җылытылган 2 × реакция катнашмасына кушылырга мөмкин (cDNA синтезы кайнар старт).Бу түбән температурада интермолекуляр баз парлашуны булдырмаска ярдәм итә.RT-PCR өчен кирәк булган берничә температура күчү җылылык велосипедчысы ярдәмендә гадиләштерелергә мөмкин.

3. Геном ДНК пычрануны киметә ：

RT-PCR белән очрашкан потенциаль кыенлык - РНКдагы геном ДНКның пычрануы.Тризол реагенты кебек яхшы РНК изоляциясе ысулын куллану, РНК әзерлеген пычратучы геном ДНК күләмен киметәчәк.Геном ДНКдан алынган продуктлардан саклану өчен, РНКны көчәйтү дәрәҗәсендәге DNase I белән эшкәртеп була, кире транскрипциягә кадәр пычратучы ДНКны бетерү өчен.DNase I ашкайнату үрнәкләрен 2,0 мм EDTAда 10 минутта 65 ° C температурада инкубацияләү белән туктатылды.EDTA магний ионнарын эретә ала, югары температурада магний ионына бәйле РНК гидролизын булдырмый.

Күчерелгән CDNA-ны геномик ДНК көчәйтү продуктларыннан аеру өчен, праймериз һәрбер аннеаль экзонны аеру өчен эшләнергә мөмкин.CDNAдан алынган PCR продуктлары пычратылган геном ДНКдан алынганнан кыска булачак.Моннан тыш, кире транскрипциясез контроль эксперимент һәр РНК шаблонында бирелгән фрагментның геном ДНК яки CDNAдан алынганын ачыклау өчен үткәрелде.Кире транскрипциясез алынган PCR продукты геномнан алынган.