Лабораториядә яңасы буларак, түбән конверсия тизлеге булган уңай үсемлекләр төркеменнән уңай үсемлекләрне тикшерү яхшы эш түгел.Беренчедән, ДНК күп санлы үрнәкләрдән бер-бер артлы чыгарылырга тиеш, аннары чит геннар PCR тарафыннан табылачак.Ләкин, нәтиҗәләр еш кына берничә әйбер булган буш һәм полосалар, ләкин сагынылган ачыклау яки ялган ачыклау барлыгын ачыклау мөмкин түгел..Мондый эксперименталь процесс һәм нәтиҗәләр белән очрашу бик ярдәмсезме?Борчылмагыз, абый сезгә трансгеник уңай үсемлекләрне җиңел һәм төгәл тикшерергә өйрәтә.

Адым 1

Дизайнны ачыклау праймериз

Сынап карала торган үрнәк буенча табылачак эндоген генны һәм экзоген генны билгеләгез, һәм праймериз дизайны өчен гендагы 100-500bp эзлеклелеген сайлап алыгыз.Яхшы праймерлар ачыклау нәтиҗәләренең төгәллеген тәэмин итә һәм ачыклау вакытын кыскартырга мөмкин (еш кулланыла торган ачыклау праймериз кушымтасын карагыз).

Игътибар: Яңа эшләнгән праймериз реакция шартларын оптимальләштерергә һәм зур масштаблы ачыклау алдыннан ачыклауның төгәллеген, төгәллеген һәм ачыклау чикләрен тикшерергә тиеш.

2 адым

Эксперимент протокол проектлау

Позитив контроль: PCR реакция системасы һәм шартларының нормаль булуын ачыклау өчен, максат фрагменты булган чистартылган ДНКны шаблон итеп кулланыгыз.

Тискәре / буш контроль: PCR системасында пычрану чыганагы булу-булмавын ачыклау өчен, шаблон буларак максат фрагменты булмаган DNK шаблонын яки ddH2O кулланыгыз.

Эчке белешмә контроль: шаблонның PCR тарафыннан табылу-булмавын тикшерү өчен, үрнәкнең эндоген генының праймер / проб комбинациясен кулланыгыз.

Игътибар:

Эксперименталь нәтиҗәләрнең дөреслеген бәяләү өчен һәр тест өчен уңай, тискәре / буш контрольләр һәм эчке контроль контрольләр куелырга тиеш.

Эксперимент әзерләү

Кулланганчы, чишелешнең тигез кушылганын күзәтегез.Әгәр явым-төшем табылса, аны эретеп, кулланганчы күрсәтмәләр буенча кушарга кирәк.2 × PCR катнашмасын тигез булмаган ион таратудан саклар өчен кулланганчы, микропипетта белән кат-кат катнаштырырга кирәк.

Игътибар:

Дәреслекне чыгарып, аны игътибар белән укыгыз, һәм кулланма таләпләренә туры китереп эксперимент алдыннан әзерләнегез.

4 адым

PCR реакция системасын әзерләгез

Эксперименталь протокол нигезендә праймерларны, H2O, һәм 2 × PCR тигез кушыгыз, центрифуга һәм аларны һәр реакция трубасына таратыгыз.

Игътибар:

Зур масштаблы яки озак вакытлы сынау өчен, PCR продуктлары аркасында аэрозол пычрануыннан эффектив саклана алырлык UNG ферменты булган PCR реакция системасын куллану тәкъдим ителә.

5 адым

Реакция шаблонын өстәгез

Туры PCR технологиясен кулланып, зәгыйфь нуклеин кислотасын чистарту процессы кирәк түгел, үрнәк шаблон 10 минут эчендә әзерләнергә мөмкин, һәм тиешле PCR реакция системасы өстәлергә мөмкин.

Игътибар:

Ярылу ысулы яхшырак ачыклау эффектына ия, һәм алынган продукт берничә ачыклау реакциясе өчен кулланылырга мөмкин.

5.1: Яфракларның туры киңәюе

Дәреслектәге рәсемнең зурлыгына карап, диаметры 2-3 мм булган яфрак тукымасын кисеп, PCR реакция системасына урнаштырыгыз.

Искәрмә: яфрак кисәкләренең PCR реакция эремәсенә тулысынча чумганын тикшерегез, артык яфрак тукымасын өстәмәгез.

5.2: Яфракны бүлү ысулы

Диаметры 5-7 мм булган яфрак тукымасын кисеп, центрифуга торбасына урнаштырыгыз.Әгәр дә сез җитлеккән яфракларны сайласагыз, зинһар, яфракның төп тамыры тукымаларын кулланмагыз.Pipette 50ul Buffer P1 лизаты центрифуга трубасына лизатның яфрак тукымасын тулысынча чумдыра алуын, җылылык велосипедчысына яки металл мунчасына урнаштыра алуын һәм 95 ° C температурада 5-10 минут эчендә лизаны тәэмин итә.

50ул Буфер P2 нейтральләштерү эремәсе кушыгыз һәм яхшылап кушыгыз.Нәтиҗә ясалган лизат шаблон буларак кулланылырга һәм PCR реакция системасына кушылырга мөмкин.

Искәрмә: шаблон күләме PCR системасының 5-10% арасында, һәм 20% тан артмаска тиеш (мәсәлән, 20μl PCR системасында 1-2μл лизис эремәсе кушыгыз, 4μлдан артык түгел).

6 адым

PCR реакциясе

PCR реакция трубасын центрифугацияләгәннән соң, ул көчәйтү өчен PCR коралына урнаштырыла.

Игътибар:

Реакция көчәйтү өчен чистартылмаган шаблон куллана, шуңа күрә көчәйтү цикллары саны чистартылган ДНК шаблонын кулланганга караганда 5-10 күбрәк цикл.

7 адым

Электрофорезны ачыклау һәм нәтиҗәләрне анализлау

М: 100бп ДНК баскычы

1 \ 4: Чистартылган ДНК ысулы

2 \ 5: Туры PCR ысулы

3 \ 6: Буш контроль

QC:

Экспериментта куелган төрле контроль тест нәтиҗәләре түбәндәге шартларга туры килергә тиеш.Otherwiseгыйсә, проблеманың сәбәбен анализларга, һәм проблема бетерелгәннән соң кабат үткәрергә кирәк.

Таблица 1. Төрле контроль төркемнәрнең нормаль тест нәтиҗәләре

* Плазмид уңай контроль буларак кулланылганда, эндоген ген тесты тискәре булырга мөмкин

Нәтиҗә хөкеме:

A. ampleрнәкнең эндоген генының тест нәтиҗәләре тискәре, бу гади PCR ачыклау өчен яраклы ДНКны үрнәктән чыгарып булмый яки алынган ДНКда PCR реакция ингибиторы бар, һәм ДНКны тагын чыгарырга кирәк.

B. ampleрнәкнең эндоген генының сынау нәтиҗәләре уңай, һәм экзоген генның сынау нәтиҗәләре тискәре, бу гади PCR ачыклау өчен яраклы ДНКның үрнәктән алынганын күрсәтә, һәм бу үрнәктә XXX ген табылмаган дип бәяләргә мөмкин.

C. ampleрнәкнең эндоген генының сынау нәтиҗәләре уңай, һәм экзоген генның сынау нәтиҗәләре уңай, бу гади PCR ачыклау өчен яраклы ДНКның үрнәктән алынганын күрсәтә, һәм ДНК үрнәгендә XXX ген бар.Тастыру экспериментлары алга таба да үткәрелергә мөмкин.

8 адым

Дизайнны ачыклау праймериз

Эксперименттан соң, 2% натрий гипохлорит эремәсе һәм 70% этанол эремәсе кулланыгыз, әйләнә-тирә мохитне пычратмас өчен эксперимент мәйданын сөртегез。