COVID-19 - каты кискен сулыш синдромы Коронавирус тибындагы йогышлы авыру. Кеше зарарлангач, иң еш очрый торган симптомнар арасында кызыш, йөткерү, сулыш кысу.

Тест үткәрү өчен кулланылган үрнәкләрне назофарингаль сваблар яки орофарингаль сваблар җыярга мөмкин.

PCR нәрсә ул?

Коронавирусны ачыклауның стандарт ысулы - полимераз чылбыр реакциясе, PCR.Бу молекуляр биологиядә киң кулланылган ысул.Ул миллионнарны махсус ДНК фрагментларына тиз күчерә ала.

Яңа коронавирус бик озын бер катлы РНК геномын үз эченә ала.Бу вирусларны PCR аша ачыклау өчен, РНК молекулалары кире транскриптаз ярдәмендә тулыландырылган ДНК эзлеклелегенә әверелергә тиеш, аннары яңа синтезланган ДНК стандарт PCR процедуралары ярдәмендә көчәйтелә ала, гадәттә RT-PCR дип аталган.

RT-PCR процессы

РНК чыгару

Бу ысулны башкару өчен вируслы РНК чыгарылырга тиеш.Уңайлы, тиз һәм эффектив аеру өчен РНК чистарту комплектлары кулланылырга мөмкин.

Вируслы РНКны коммерция комплекты ярдәмендә чыгару өчен, башта микроцентрифуга трубасына үрнәк өстәгез, аннары лизис буферы белән кушыгыз.Буфер югары денатурацияләнгән һәм гадәттә фенол һәм гуанидин изотиокянатыннан тора.Моннан тыш, вируслы РНКның изоляциясен тәэмин итү өчен, RNase ингибиторлары, гадәттә, лизис буферында бар.

Лизис буферын кушканнан соң, вортексны катнаш трубаны импульс белән бүлмә температурасында инкубацияләгез.Аннары вирус лизис буферы белән тәэмин ителгән югары денатурация шартларында лизизацияләнә.

Ampleрнәк лизланганнан соң, чистарту процедурасы өчен центрифуга трубасы кулланыла.Ampleрнәк центрифуга трубасына салынган, аннары центрифуга.

Бу процедура каты фазаны чыгару ысулы, анда стационар фаза кремний гел матрицасыннан тора.

Оптималь тоз һәм рН шартларында РНК молекулалары кремний мембранасына бәйләнә.

Шул ук вакытта протеин һәм башка пычраткыч матдәләр чыгарыла.

Centентрифугадан соң, центрифуга трубасын чиста җыю трубасына салыгыз, фильтрны ташлагыз, аннары юу буферы кушыгыз.

Трубаны яңадан центрифуга урнаштырыгыз, юу буферын мембрана аша мәҗбүр итегез.Бу мембранадагы калган пычракларны бетерәчәк, РНКны кремний геленә бәйләп кенә калдырачак.

Ampleрнәк юылганнан соң, трубаны чиста микроцентрифуга торбасына салыгыз һәм элитация буферын өстәгез.

Аннары мембрана аша элитация буферын көчләү өчен центрифугацияләнә.Элитация буферы вируслы РНКны әйләндерү баганасыннан чыгарып, чистартылган РНКны протеиннар, ингибиторлар һәм башка пычраткыч матдәләрсез ала.

Адым 2

Катнаш концентрат

Вируслы РНКны чыгарганнан соң, чираттагы адым - реакция катнашмасын PCR көчәйтү өчен әзерләү.Бу адымда концентрат кулланыла.Бу концентрацияләнгән чишелеш - премикс, кире транскриптаз, нуклеотидлар, алга праймер, кире праймер, TaqMan зонасы һәм ДНК полимеразыннан торган премиксланган концентрацияләнгән чишелеш.

Ниһаять, бу реакция катнашмасын тәмамлау өчен, РНК шаблоны өстәлә.Трубалар импульс вортексинг белән кушылалар, аннары реакция катнашмасы PCR тәлинкәсенә салына.PCR тәлинкәсендә гадәттә 96 скважина бар һәм бер үк вакытта берничә үрнәк анализлый ала.

3 адым

PCR көчәйтү

Аннары, тәлинкәне PCR машинасына урнаштырыгыз, ул термик велосипедчы.

Реаль вакыттагы RT-PCR 2019 роман коронавирусын ачыклау өчен RdrRP ген, E ген һәм N гендагы максат эзлеклелеген көчәйтеп кулланыла.Максатлы ген сайлау праймер һәм тикшерү эзлеклелегенә бәйле.

RT-PCRның беренче адымы - кире транскрипция.Бер-берсен тулыландыручы ДНК синтезланган, ул PCR кире пример белән башланган, вируслы РНК геномының тулы өлешенә бәйләнгән.Аннары кире транскриптаз вируслы РНКны тулыландыручы ДНКны синтезлау өчен праймерның 3′endенә ДНК нуклеотидлары өсти.Бу адымның температурасы һәм озынлыгы праймерларга, максатлы РНКга һәм кулланылган кире транскриптазга бәйле.

Алга таба, башлангыч денатурация адымы кулланыла, бу РНК-ДНК гибридының денатурациясенә китерә.Бу адым ДНК полимеразын активлаштыру өчен кирәк.Шул ук вакытта кире транскриптаз актив булмаган.

PCR җылылык циклыннан тора.Eachәр цикл денатурация, аннальинг һәм киңәйтү адымнарыннан тора.

Денатурация адымы реакция камерасын 95 градус җылытуны һәм ике катлы ДНК шаблонын денатурацияләү өчен куллануны үз эченә ала.

Киләсе адымда реакция температурасы 58 градуска кадәр төшә, алга таба праймерның бер полосалы ДНК шаблонының тулы өлешенә ябышырга мөмкинлек бирә.Анналь температурасы турыдан-туры праймерның озынлыгына һәм составына бәйле.

Киңәйтү адымында, ДНК полимеразы яңа ДНК полосасын синтезлый, ул ДНК шаблоны полосасын тулыландыра.Реакция катнашмасыннан 5′to 3′ юнәлештә шаблонга бушлай ядрәләр өстәп.Бу адымның температурасы кулланылган ДНК полимеразына бәйле.

Беренче циклдан соң, ике катлы ДНК максаты алына.

Аннары, икенче циклга керегез.Ике катлы ДНК ике юллы ДНК молекулаларын чыгару өчен денатурацияләнгән.

Киләсе адымда реакция температурасы түбәнәйтелә, праймериз бер полосалы ДНК шаблонына ябыштырыла, һәм Так-кеше зонасы максатлы ДНКның тулы өлешенә ябыштырыла.

TaqMan зонасы олигонуклеотид зонасының 5′end белән ковалент рәвештә бәйләнгән флорофордан тора.Велосипедчының яктылык чыганагы белән дулкынлангач, флюорфор флюоресенция чыгара.Моннан тыш, зонд 3′end-та сүндергечтән тора.Хәбәрче генның сүндергечкә якынлыгы флюоресенцияне ачыкларга комачаулый.

Киңәйтү адымында, ДНК полимерасы яңа юлны синтезлый.Полимераз TaqMan зонасына җиткәч, аның эндоген 5′нуклаз активлыгы зонаны чистарта, буяуны сүндергечтән аера.

PCR-ның һәр циклы белән буяу молекулалары күбрәк чыгарыла, нәтиҗәдә синтезланган ампликоннар санына пропорциональ флюоресенция интенсивлыгы арта.

Бу ысул үрнәктә булган эзлеклелек санын бәяләргә мөмкинлек бирә.Ике юллы ДНК фрагментлары саны һәр циклда икеләтә арта.Шуңа күрә PCR бик кечкенә үрнәкләрне анализлау өчен кулланылырга мөмкин.

Флуоресцент сигналны үлчәү өчен вольфрам галоген лампасы, дулкынландыргыч фильтр, рефлектор, линза, эмиссия фильтры һәм корылма кушылган җайланма куллану CCD камерасы.

4 Адым

Флуоресцент сигналны үлчәү өчен вольфрам галоген лампасы, дулкынландыргыч фильтр, рефлектор, линза, эмиссия фильтры һәм корылма кушылган җайланма куллану CCD камерасы.

Лампадан фильтрланган яктылык рефлекторда чагыла, конденсатор линзасы аша уза һәм һәр тишекнең үзәгенә юнәлтелгән.Аннары тишектән чыккан флуоресцент көзгедән чагыла, эмиссия фильтры аша уза һәм КД камерасы белән ачыклана.Eachәр PCR циклында үз-үзен дулкынландырган флюорфор яктылыгы КД белән ачыклана ала.

Ул алынган яктылыкны санлы мәгълүматка әйләндерә.Бу ысул реаль вакыттагы PCR дип атала, һәм ул PCR реакциясенең барышын реаль вакытта күзәтергә мөмкинлек бирә.