PCR (полимераз чылбыр реакциясе) - 30 елдан артык тарихы булган витро ДНК көчәйтү технологияләренең берсе.

PCR технологиясе 1983-нче елда АКШның etетус шәһәреннән Кэри Маллис тарафыннан пионер булып эшләнде.Муллис эше өчен 1993-нче елда химия буенча Нобель премиясенә лаек булды.

PCR төп принциплары

PCR максатчан ДНК фрагментларын миллионнан артык тапкыр көчәйтә ала.Принцип ДНК полимеразының катализы астында, ата-ана полосасы ДНКны шаблон һәм махсус праймер итеп киңәйтү өчен башлангыч нокта итеп куллана.Ул витрода денатурация, аннальинг һәм киңәйтү кебек адымнар аша кабатлана.ДНК процессы ата-ана шаблоны ДНКны тулыландыра.

Стандарт PCR процессы өч этапка бүленә:

1.Денатурация: ДНКның ике юлын аеру өчен югары температураны кулланыгыз.ДНКның ике катлы водород бәйләнеше югары температурада өзелә (93-98 ℃).

2.Аннальинг: Ике катлы ДНК аерылганнан соң, температураны түбәнәйтегез, шулай итеп праймер бер полосалы ДНК белән бәйләнә ала.

3. Киңәйтү: ДНК полимеразасы температура төшкәндә бәйләнгән праймериздан ДНК полосалары буенча тулыландырылган юлларны синтезлый башлый.Озайту тәмамлангач, цикл тәмамлана, һәм ДНК фрагментлары саны икеләтә арта

Бу өч адымны 25-35 тапкыр кабатлап, ДНК фрагментлары саны тиз артачак.

PCR-ның тапкырлыгы шунда ки, төрле праймерлар төрле максатлы геннар өчен эшләнергә мөмкин, шулай итеп максатлы ген фрагментлары кыска вакыт эчендә көчәйтелә ала.

Әлегә PCRны өч категориягә бүлеп була: гади PCR, флуоресцент санлы PCR һәм санлы PCR.

Гади PCRның беренче буыны

Максатлы генны көчәйтү өчен гади PCR көчәйтү коралын кулланыгыз, аннары продуктны табу өчен агароза гели электрофорезын кулланыгыз, бары тик сыйфатлы анализ ясарга мөмкин.

Беренче буын PCR-ның төп кимчелекләре:

1. Конкрет булмаган көчәйтү һәм ялган уңай нәтиҗәләргә омтылу.

2. Ачыклау озак вакыт ала һәм операция авыр.

3.Сыйфатлы тест үткәрергә мөмкин

Икенче буын Real-Time PCR

Real-Time PCR, шулай ук ​​qPCR дип атала, реакция системасының барышын күрсәтә алган флуоресцент зоналар куллана, һәм флюоресцент сигналлар туплануы аркасында көчәйтелгән продуктларның туплануын күзәтә, һәм нәтиҗәләрне флуоресцент сызык аша хөкем итә.Аны Cq кыйммәте һәм стандарт сызык ярдәмендә бәяләргә мөмкин.

QPCR технологиясе ябык системада алып барылганга, пычрану ихтималы кими, һәм флюоресенция сигналын санлы ачыклау өчен күзәтеп була, шуңа күрә ул клиник практикада иң киң кулланыла һәм PCR-ның өстенлекле технологиясенә әверелә.

Реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCRда кулланылган флуоресцент матдәләргә бүләргә мөмкин: TaqMan флуоресцент зонасы, молекуляр маяклар һәм флюоресцент буяу.

1) TaqMan флуоресцент тикшерү:

PCR көчәйтү вакытында пар праймер өстәгәндә билгеле бер флуоресцент зонасы өстәлә.Зонд - олигонуклеотид, һәм ике очында да хәбәрче флуоресцент төркеме һәм сүндергеч флуоресцент төркеме бар.

Прибор тотрыксыз булганда, хәбәрче төркеме чыгарган флуоресцент сигнал сүндерү төркеме тарафыннан үзләштерелә;PCR көчәйтү вакытында, Так ферментының 5′-3 ′ экзонуклази активлыгы тикшерелә һәм деградацияләнә, хәбәрче флуоресцент группа һәм сүндергеч ясый Флуоресцент төркем аерыла, шулай итеп флуоресцент мониторинг системасы флюоресенция сигналын ала ала, ягъни ДНК полосасы көчәйтелгәндә, флюоресцент сигналның туплануы.

2) SYBR флюоресцент буяу:

PCR реакция системасында артык SYBR флюоресцент буяу өстәлә.SYBR флюоресцент буяу махсус ДНКга кертелмәгәннән соң, ул флуоресцент сигнал чыгара.Чылбырга кертелмәгән SYBR буяу молекуласы бернинди флуоресцент сигнал да чыгармый, шуның белән флуоресцент сигналны тәэмин итә PCR продуктларының артуы PCR продуктларының артуы белән тулысынча синхронлаша.SYBR ике катлы ДНК белән генә бәйләнә, шуңа күрә эретү сызыгы PCR реакциясенең конкрет булуын ачыклау өчен кулланылырга мөмкин.

3) Молекуляр маяк:

Бу 5 һәм 3 очында якынча 8 база чәч структурасын формалаштыручы, икеле маркалы олигонуклеотид зонасы.Ике очындагы нуклеин кислотасы эзлеклелеге бер-берсенә бәйләнгән, флуоресцент группа һәм сүндерү төркеме тыгыз булырга мөмкин.Якын, флюоресенция җитештерелмәячәк.

PCR продукты барлыкка килгәннән соң, анналь процесс вакытында молекуляр маякның урта өлеше билгеле бер ДНК эзлеклелеге белән парлаштырылган, һәм флуоресцент ген флюоресенция чыгару өчен сүндергеч геннан аерылган.

Икенче буын PCR-ның төп кимчелекләре:

Сәнгатьчәнлек әле җитми, аз күчерелмә үрнәкләрне табу дөрес түгел.

Фон кыйммәтенең йогынтысы бар, һәм нәтиҗә комачаулый.

Реакция системасында PCR ингибиторы булганда, ачыклау нәтиҗәләре комачаулый.

Өченче буын санлы PCR

Санлы PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) максат ноктасының күчерелмә санын соңгы ноктаны ачыклау аша исәпли, һәм эчке контроль һәм стандарт кәкреләр кулланмыйча төгәл абсолют санны ачыклый ала.

Санлы PCR соңгы ноктаны ачыклауны куллана һәм Ct кыйммәтенә (цикл бусагасына) бәйле түгел, шуңа күрә санлы PCR реакциясе көчәйтү эффективлыгына азрак тәэсир итә, һәм PCR реакция ингибиторларына толерантлык яхшыра, югары төгәллек һәм репродуктивлык белән.

Highгары сизгерлек һәм югары төгәллек характеристикалары аркасында, ул PCR реакция ингибиторларына җиңел комачауламый, һәм ул тикшерү һәм куллану ноктасына әверелгән стандарт продуктларсыз чын абсолют санлашуга ирешә ала.

Реакция берәмлегенең төрле формалары буенча аны өч төп төргә бүлеп була: микрофлуид, чип һәм тамчы системалары.

1) Микрофлуидик санлы PCR, mdPCR:

Микрофлуид технологиясенә нигезләнеп, ДНК шаблоны аерылган.Микрофлуид технологиясе нано-яңарту үрнәген яки кечерәк тамчылар тудыруны тормышка ашыра ала, ләкин тамчыларга махсус adsorption ысулы кирәк, аннары PCR реакция системасы белән берләштерелә.mdPCR әкренләп башка ысуллар белән кабул ителде.

2) Тамчы нигезендә санлы PCR, ddPCR:

Ampleрнәкне тамчыларга эшкәртү өчен, суда майлы тамчы җитештерү технологиясен кулланыгыз, һәм нуклеин кислотасы молекулалары булган реакция системасын меңләгән наноскаль тамчыларына бүлегез, аларның һәрберсендә нуклеин кислотасы максатлы молекуласы юк, яки сынау өчен берничә нуклеин кислотасы максатлы молекуласы бар.

3) Чипка нигезләнгән санлы PCR, cdPCR:

Кремний вафаларда яки кварц пыялада күп микротублар һәм микрокавитлар язу өчен интеграль сыеклык юл технологиясен кулланыгыз, һәм эремә агымын төрле контроль клапаннар аша контрольдә тотыгыз, һәм абсолют санга ирешү өчен үрнәк сыеклыкны шул ук зурлыктагы нанометрларга бүлегез.

Өченче буын PCR-ның төп кимчелекләре:

Theиһазлар һәм реагентлар кыйммәт.

Шаблонның сыйфат таләпләре югары.Әгәр дә шаблон саны микросистема саныннан артса, санап булмый, һәм ул бик кечкенә булса, санның төгәллеге кимиячәк.

Ялган позитивлар специаль булмаган көчәйтү булганда барлыкка килергә мөмкин.