PCR, күп PCR, PCR ситуасында, Кире PCR, RT-PCR, qPCR （1）-PCR

Төрле PCR төшенчәләрен, адымнарын һәм детальләрен аерырбыз

Ⅰ. PCR

Полимераз чылбыр реакциясе, PCR дип атала, молекуляр биологик технология, ул махсус ДНК фрагментларын киңәйтү өчен кулланыла.Аны витрода махсус ДНК репликасы итеп карарга мөмкин.ДНК полимеразы (ДНК полимераз I) 1955 елда ук ачылган, һәм эксперименталь кыйммәткә ия булган Э.Колиның Кленов фрагменты 1970-нче еллар башында доктор Х. Кленов тарафыннан ачылган, ләкин бу фермент температурага түземле булмаганга, югары температура бозылырга мөмкин, шуңа күрә ул полимераз чылбыр реакциясенә туры килми.Бүген кулланыла торган ферментлар (Так полимераз дип атала), 1976-нчы елда кайнар язгы бактерия Термус суыннан аерылды. Аның характеристикасы - ул югары температурага каршы тора ала һәм идеаль фермент, ләкин 1980-нче еллардан соң киң кулланыла.PCR-ның оригиналь примитив прототибының оригиналь төшенчәсе 1971-нче елда доктор К. Джелл Клеппе тәкъдим иткән ген ремонтлау һәм күчереп алу белән охшаган. Ул беренче гади һәм кыска вакытлы ген күчермәсен бастырган (PCR-ның беренче ике цикл реакциясенә охшаган).Бүген PCR эшләнгән доктор Кэри Б. Маллис тарафыннан 1983-нче елда эшләнгән. Доктор Маллис ул елны PE компанияләренә хезмәт күрсәткән, шуңа күрә PE PCR индустриясендә махсус статуска ия.Доктор Маллис рәсми рәвештә Саики һәм башкалар белән беренче бәйләнешле кәгазьне 1985-нче елда бастырып чыгарды. Шул вакыттан алып PCR куллану көненә меңләгән чакрым, һәм бәйләнешле кәгазьләрнең сыйфаты башка бик күп тикшеренү ысулларын кабул итмәскә мөмкин.Соңыннан, PCR технологиясе биологик фәнни тикшеренүләрдә һәм клиник кушымталарда киң кулланыла, молекуляр биология тикшеренүләренең иң мөһим технологиясенә әверелә.Маллис шулай ук ​​1993-нче елда химия буенча Нобель премиясенә лаек булды.

PCRПринцип

PCR технологиясенең төп принцибы ДНКның табигый репликация процессына охшаган, һәм аның үзенчәлеге максатлы эзлеклелекнең ике очын да тулыландыручы олигонуклеотид примерына бәйле.PCR дегерация-аннальинг-киңәйтүче өч төп реакция адымыннан тора: "ДНК шаблонының дегерациясе: билгеле бер вакыт эчендә ДНК шаблоны якынча 93 ° C җылытылганнан соң, ике чылбырлы ДНК өчен икеләтә ДНК чишелеше, ДНК калдыру шаблонының PCR көчәйтү көче белән, аны бер чылбырлы ит, киләсе турга әзерләнү өчен.D ДНК шаблонының аннальинг (кушылмасы): ДНК шаблоны җылытылып, бер чылбырда бозылганнан соң, температура 55 ° C ка кадәр төшә.Праймерның тулы эзлеклелеге һәм шаблон ДНК бер чылбырлы.- Праймерның киңәюе: ДНК шаблоны - пример бәйләү TaqDNA полимераз эшенә нигезләнә, реакция чималы буларак dNTP белән.Күчерү принцибын саклагыз, шаблон ДНК чылбырын тулыландыручы яңа ярым сакланган күчермә чылбырын синтезлагыз, һәм циклның дегерация-аннальинг-киңәйтү өч процессы күбрәк "ярым сакланган күчермә чылбыры" ала ала, һәм бу яңа чылбыр кабат киләсе цикл өчен шаблон булыгыз.Opикләнүне тәмамлау өчен 2-4 минут кирәк, максатлы ген 2-3 сәгать эчендә берничә миллион тапкыр көчәйтелергә мөмкин.

СтандартPCRРеакция системасы

PCR реакциясенең биш элементы

PCR реакциясендә, нигездә, биш төр матдә бар, алар пример, фермент, dNTP, шаблон һәм буфер (Mg2 + кирәк).[PCR процедурасы]

Стандарт PCR процессы өч этапка бүленә

1. ДНК дегерациясе (90 ° C-96 ° C): җылылык хәрәкәте астында ике чылбырлы ДНК шаблоннары, водород бәйләнешләре өзелә, бер чылбырлы ДНК формалаштыра.

2. Аннальинг (25 ℃ -65 ℃): Система температурасы кими, праймер ДНК шаблоны белән кушылып, җирле икеле чылбыр формалаштыра.

3. Киңәйтү (70 ℃ -75 ℃): Так ферменты (якынча 72 ° C, иң яхшы активлык) ярдәмендә, DNTP чимал буларак кулланыла, праймерның 5 ′ очыннан ′ 3 ′ очына кадәр сузыла, синтез һәм шаблон бер-берсенең ДНК чылбырын тулыландыралар.

Eachәр цикл денатурацияләнә, ябыштырыла һәм киңәйтелә, ДНК эчтәлеген икеләтә арттыра.Хәзерге вакытта, кыска көчәйтү өлкәсе аркасында, кайбер PCR бик кыска вакыт эчендә кабатланырга мөмкин, хәтта Так ферменты активлыгы оптималь булмаса да, аны ике этапка үзгәртергә мөмкин, ягъни аннальлау һәм киңәйтү бер үк вакытта 60 ° C-65 ° C башкарылырга мөмкин.Көтү һәм суыту процессын киметү һәм җавап тизлеген яхшырту өчен.

PCR реакция үзенчәлекләре

● -гары үзенчәлек

PCR реакциясенең конкрет хәлиткеч факторлары: prim Праймер белән шаблонның ДНК шаблоны.BasБаз парлаштыру принцибы.Ta TaqDNA полимераз синтез реакциясенең тугрылыгы.The Максатлы генның үзенчәлеге һәм консервативлыгы.

Праймерлар һәм шаблоннарның дөрес кушылмасы ачкыч.Праймерны һәм шаблонны бәйләү һәм пример чылбырын киңәйтү эшкәртү нигезенә туры килү принцибына нигезләнгән.Полимераз синтез реакцияләренең тугрылыгы һәм реакциядә шаблонны һәм праймерны бәйләү (кушылу) ясау өчен Так ДНК полимеразының югары температурасына каршы тору югары температурада башкарылырга мөмкин.Комбинациянең үзенчәлеге зурайган.Клип югары дәрәҗәдә дөреслекне саклый ала.Highгары консервативлык һәм югары консервативлык белән максатчан генетик төбәкне сайлап, аның үзенчәлеге югарырак.

● Sгары сизгерлек

PCR продуктларының җитештерү күләме индекс белән арттырыла, ул Пикерның башлангыч шаблонын киңәйтә ала (PG = 10-12), микроконтроль дәрәҗәсен микрограммалар дәрәҗәсенә кадәр күтәрә ала (μg = -6).Максатлы күзәнәкләрне 1 миллион күзәнәктән табарга мөмкин;вирусларны ачыклаганда, PCR сизгерлеге 3 RFU (буш таплар барлыкка килгән берәмлекләр) җитә ала;бактерия фәнендә минималь ачыклау дәрәҗәсе 3 бактерия.

● Гади һәм тиз

PCR чагылышы югары температуралы Так ДНК полимеразын куллана, ул берьюлы реакция чишелешен өсти, ягъни ДНК көчәйтү эремәсендә һәм су мунчасында чүлмәкнең дегерация-анналь-киңәйтү реакциясе.Гадәттә, көчәйтү реакциясе 2 - 4 сәгать эчендә тәмамлана.Киңәйтелгән продуктлар, гадәттә, электр кылыч белән анализлана, һәм изотоплар кулланырга кирәк түгел, радиоактив пычрану юк, җиңел пропагандалау.

The ampleрнәкнең чисталыгы түбән

Вирусларны, бактерияләрне һәм культура күзәнәкләрен аерырга кирәкми.ДНК чимал продуктлары һәм РНК көчәйткечләр буларак кулланылырга мөмкин.ДНК көчәйтүне ачыклау турыдан-туры кан, тән сыеклыгы, йөткерү юу сыеклыгы, чәч, күзәнәкләр, тере тукымалар кебек клиник үрнәкләр ярдәмендә кулланылырга мөмкин.

PCRгомуми проблемалар

Negative Ялган тискәре, көчәйтелгән полосалар юк

PCR реакциясенең төп этапларына түбәндәгеләр керә: template шаблон нуклеин кислоталарын әзерләү, prim праймерларның сыйфаты һәм үзенчәлеге, enzy ферментларның сыйфаты ④ PCR цикл шартлары.Сәбәбен табу шулай ук ​​югарыдагы сылтамалар өчен анализланырга һәм өйрәнелергә тиеш.

Шаблоннар: template Шаблонда төрле протеиннар бар, ② Шаблонда Так фермент ингибиторы бар, template Шаблондагы протеин юкка чыгарылмый, аеруча хромосомадагы группа протеины.N Деминер нуклеин кислотасының дегерациясе яхшы түгел.Ферментларның һәм праймерларның сыйфаты яхшы булганда, көчәйтү полосасы юк, бу, мөгаен, үрнәкләрне ашкайнату.Шаблон нуклеин кислотасын чыгару процессында ниндидер хата бар, шуңа күрә ашкайнатуның эффектив һәм тотрыклы чишелешен әзерләү өчен, аның процедурасы тотрыклы булырга тиеш һәм үз-үзеңне үзгәртмәскә тиеш.

Ферментны инакивацияләү: яңа фермент яки иске дә, яңа ферментлар да бергә кулланылырга тиеш, фермент эшчәнлегенең югалуы яки җитмәве, ялган тискәре нәтиҗәләргә китерә.Әйтергә кирәк, Так ферменты яки этиди бромид кайвакыт онытыла.

Праймер: праймерның сыйфаты, праймер концентрациясе, һәм ике праймерның концентрациясе симметриялеме.Бу PCR уңышсызлыгының гомуми сәбәбе яки арткан төркем идеаль түгел һәм таралырга мөмкин.Кайбер партия саннарының праймериз сыйфаты белән проблемалар бар.Ике праймерның югары концентрациясе һәм түбән концентрациясе бар, түбән эффективлык асимметрик көчәйтүгә китерә.Каршы чаралар: units Берәмлекләрне синтезлау өчен яхшы праймер сайлагыз.Prim Праймерның концентрациясе ОД кыйммәтенә генә түгел, ә агар шикәр гели электрофорезы ясау өчен праймерның оригиналь сыеклыгына да игътибар итә.Праймер полосасы зонасы булырга тиеш, һәм ике праймерның яктылыгы гадәттә эзлекле булырга тиеш.Билбау, PCR бу вакытта уңышсыз булырга мөмкин, һәм ул пример синтезы берәмлеге белән чишелергә тиеш.Праймер югары булса, яктылыгы түбән, һәм аның концентрациясе эретелгәндә балансланырга тиеш.③ Праймерны түләргә һәм югары концентрациядә сакларга кирәк, суыткычның күп туңдырылу яки озын суыткыч өлешләре, бу праймерның начарлануына һәм бозылуына китерәчәк.The Праймерның дизайны акылсыз, мәсәлән, праймерның озынлыгы җитәрлек түгел, һәм ди кластер праймерлар арасында барлыкка килә.

Mg2 + концентрациясе: Mg2 + ион концентрациясе PCR көчәйтү эффективлыгына зур йогынты ясый.Артык концентрация PCR көчәйтүнең каршы җенесен киметергә мөмкин.Концентрация артык түбән булса, PCR көчәйтү чыганагы хәтта PCR көчәйтү көчен киңәйтү полосасысыз эшләячәк.

Реакция күләмен үзгәртү: PCR көчәйтүдә кулланылган күләм 20ул, 30ул, һәм 50ул яки 100уЛ, PCR көчәйтү өчен заявкаларның зур күләме фәнни тикшеренүләр һәм клиник тестларның төрле максатлары нигезендә куелган.20ул кебек кечкенә томнар ясаганнан соң, зурлыкны ясаганда шнур шартын ясарга кирәк, югыйсә ул уңышсыз булачак.

Физик сәбәпләр: PCR көчәйтү өчен трансформация бик мөһим.Әгәр дегерация температурасы түбән булса, дегерация вакыты кыска булса, ул ялган тискәре күренешләрдә булырга мөмкин;бик түбән аннальинг температурасы махсус булмаган көчәйтүгә китерергә һәм көчәйтүнең эффективлыгын киметергә мөмкин.PCR көчәйтү эффективлыгын киметү өчен праймерлар һәм шаблоннар комбинациясенә югары йогынты ясыйлар.Кайвакыт стандарт термометрларны кулланырга кирәк, үзгәрүчәнлекне, аннальингны һәм киңәйтелгән температураны яки суда эри торган пешерүне ачыклау өчен, бу PCR эшләмәү сәбәпләренең берсе.

Максат эзлеклелеге вариантлары: Әгәр максатчан эзлеклелек килеп чыкса, мутация яки бетерү, прототип һәм шаблон комбинациясе берләштерелә, яки максат эзлеклелеге булмаганлыктан, праймер һәм шаблон өстәмә эзлеклелекне югалтачак, һәм PCR көчәйтү уңышлы булмас.

● Ялган уңай

PCR көчәйтү полосасы максат эзлеклелеге белән туры килә, һәм кайвакыт аның полосасы тагын да чиста һәм югарырак.

Праймериз дизайны урынлы түгел: сайланган көчәйтү эзлеклелеге һәм максатсыз көчәйтү эзлеклелеге гомологик, шуңа күрә PCR көчәйтелгәндә, көчәйтелгән PCR продуктлары максатсыз эзлеклелек.Максатлы эзлеклелек бик кыска яки праймер бик кыска, һәм ул ялган позитив булырга мөмкин.Яңадан эшләргә кирәк.

Максатлы эзлеклелектә яки көчәйтү продуктларында кросс пычрануы: Бу пычрануның ике сәбәбе бар: Беренчедән, бөтен геном яки зур сегментларның кросс-пычрануы, ялган позитивларга китерә.Мондый ялган позитивны түбәндәге ысуллар белән чишеп була: Операция вакытында сак һәм йомшак булыгыз, максатчан эзлеклелектә үрнәк мылтыкка кермәсен яки центрифуга трубасыннан чыгарылмасын.Highгары температурага каршы тора алмаган ферментлардан һәм матдәләрдән кала, барлык реагентлар яки җиһазлар югары басым белән дезинфекцияләнергә тиеш.Centентрифуга торбалары һәм үрнәкләр берьюлы кулланылырга тиеш.Кирәк булганда, үрнәкләр өстәгәнче, реакция трубасы һәм реагент ультрафиолет нурларына тәэсир итәләр, булган нуклеин кислотасын юк итәләр.Икенчедән, һаваның пычрануындагы кечкенә кисәкләр.Бу кечкенә фрагментлар максат эзлеклелегеннән кыскарак, ләкин аларда билгеле бер гомология бар.Аны бер-берсе белән бүләргә мөмкин.Праймерларны тулыландырганнан соң, PCR продуктын киңәйтергә мөмкин, бу ялган позитив җитештерүгә китерәчәк.Аны оя PCR ысулын киметү яки бетерү өчен кулланырга мөмкин.

N Билгесез көчәйтү полосасы барлыкка килү

PCR көчәйтүдән соң барлыкка килгән полосалар көтелгән зурлыкка туры килми, яки зур яки кечкенә, яки шул ук вакытта, яки шул ук вакытта, махсус көчәйтү полосалары һәм махсус булмаган көчәйтү полосалары.Конкрет булмаган полосаларның барлыкка килүе: Беренчедән, праймерлар максат эзлеклелеген тулыландырмыйлар, яки ди кластер формалаштыру өчен праймерның полимеризациясе.Икенчесе - MG2 + ионнары концентрациясе артык зур, анналь температурасы бик түбән, һәм PCR цикллары саны белән бәйле.Икенчедән, ферментларның сыйфаты һәм күләме.Еш кына кайбер чыганакларның ферментлары махсус булмаган полосаларга мохтаҗ һәм бүтән чыганак ферментлары булмый.Кайвакыт ферментларның специаль булмаган көчәйтүе дә була.Каршы чаралар: кирәк булса, яңадан ясалган җәлеп итүчеләр.Фермент күләмен киметү яки башка чыганак ферментын алыштыру.Беренчел күләмне киметү, шаблоннар күләмен тиешенчә арттыру, цикллар санын киметү.Аннальинг температурасын дөрес күтәрегез яки ике температура ноктасын кулланыгыз (93 ° C дегерация, аннальлау һәм якынча 65 ° C).

Ak Ябык тасма яки магнитофон

PCR көчәйтү кайвакыт кулланыла яки ябыштырылган яки келәмгә охшаган каеш кебек тоела.Шуңа күрә, ферментларның артык күләме яки ферментның сыйфаты начар булу сәбәпле, dNTP концентрациясе артык зур, Mg2 + концентрациясе артык зур, анналь температурасы бик түбән, һәм цикллар саны артык.Каршы чаралар: - Ферментлар күләмен киметү, яки башка чыганак ферментын үзгәртү.N DNTP концентрациясен киметегез M Mg2 + концентрациясен дөрес киметегез.Temp Шаблоннар санын арттыру һәм цикл санын киметү.

Бәйләнешле продуктлар

PCR Герое (буяу белән)

◮ Higherгары тугрылык: гади Так ферментыннан 6 тапкыр;

Aster Тизрәк көчәйтү тизлеге

Template Күбрәк шаблон адаптация

Ampl Higherгары көчәйтү эффективлыгы

◮ Экологик толерантлык көчлерәк: бер атнага 37 ° C ка урнаштырыла, 90% тан артык активлык саклый;

◮ Аның 5 '→ 3' ДНК полимераз активлыгы һәм 5 '→ 3' экзонуклаз активлыгы, 3 '→ 5' экзонуклаз активлыгы юк.

PCR Easyᵀᴹ (Буяу белән)

Уникаль реакция системасы һәм югары эффективлык Taq DNA полимерасы PCR реакциясен көчәйтү эффективлыгын, үзенчәлеген һәм сизгерлеген арттыра.

ТР-qPCR Easyᵀᴹ (Бер адым) -SYBR Яшел I.

◮ Бер адымлы комплект кире транскрипция ясый һәм qPCR бер трубада ике реакция ясый, бары тик RNA шаблонын, махсус PCR праймерларын һәм RNase-Free ddH өстәргә кирәк.₂O.

Kit Комплект вируслы РНКны тиз һәм эффектив рәвештә анализлый ала яки РНКны эзли ала.

Kit Комплектта уникаль Foregene кире транскрипция реагенты һәм Foregene HotStar Taq DNA полимерасы уникаль реакция системасы белән кушылып, реакциянең көчәйтү эффективлыгын һәм үзенчәлеген яхшырту өчен кулланыла.

◮ Оптимальләштерелгән реакция системасы реакцияне ачыклау сизгерлеген, җылылык тотрыклылыгын һәм яхшырак толерантлыкны булдыра.

◮ RT-qPCR җиңел^TM(Бер адым) -SYBR Green I комплекты ROX эчке белешмә буяу белән килә, бу сигнал фонын һәм скважиналар арасындагы сигнал хаталарын бетерү өчен кулланыла ала, бу клиентларга санлы PCR коралларының төрле модельләрендә куллану өчен уңайлы.

RT Easyиңел^TMII (Мастер Премикс өчен өчен беренче юллы CDNA синтезыReal Time PCR)

- 2 минут эчендә шаблондагы gDNAны бетерә алган gDNAны бетерү өчен эффектив сәләт.

- Эффектив кире транскрипция системасы, беренче CDNA синтезын тәмамлау өчен 15 минут вакыт кирәк.

- Катлаулы шаблоннар: югары GC эчтәлеге булган шаблоннар һәм катлаулы икенчел структурасы да югары эффективлык белән кире кайтарылырга мөмкин.

-Гары сизгерлек кире транскрипция системасы, pg дәрәҗәсендәге шаблоннар шулай ук ​​югары сыйфатлы CDNA ала ала.

- Кире транскрипция системасы югары җылылык тотрыклылыгына, оптималь реакция температурасы 42 and, һәм ул әле 50 at тә яхшы кире транскрипция күрсәткечләренә ия.