RT-qPCR - молекуляр биологиянең төп эксперименты, һәм аның белән һәркем таныш булырга тиеш.Бу, нигездә, өч адымны үз эченә ала: РНК чыгару, CDNAга кире транскрипция һәм реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCR.Бу ярдәм итми, нәрсә була?Мөгаен, проблема бардыркире транскрипция эксперименты!Кире транскрипция экспериментына РНК, dNTP, праймерлар һәмкире транскриптазцентрифуга трубасына һәм яхшылап кушылыгыз, ләкин фактик эш процессында әле күп игътибарга лаек детальләр бар.Әйдәгез моны белик!

РНК сыйфатын ничек бәяләргә?
CDNA алу өчен, РНК сыйфаты бик мөһим!РНК сыйфатын нигездә ике аспекттан табып була:
(1) РНК бөтенлеге:РНК бөтенлеге агароза гели электрофорезы белән расланырга мөмкин. Эукариотларны мисал итеп алсак, тулы РНКның өч ачык полосасы бар, зурдан кечегә кадәр молекуляр авырлыклар 28S, 18S, 5S, һәм 28S 18S белән чагыштырганда ике тапкыр якты;өч полосаны күреп була, ләкин тасма тибы төссезләнгән яки Диффузия РНК өлешчә деградацияләнгән дигән сүз.Бу вакытта зинһар, кире транскрипция реакциясен эшләгез һәм шаблон кертүне тиешенчә арттырыгыз.кечкенә молекуляр авырлыктагы полоса яки бернинди тасма гына күренмәсә, РНК бөтенләй бозылган һәм яңадан чыгарылырга тиеш.Agilent 2100 иң югары схема һәм RIN кыйммәте белән РНКның бөтенлеген күрсәтә.Нуклеин кислотасы тотрыклы булса, электроферограмманың нигезе яссы;нуклеин кислотасы каты деградацияләнсә, база тигез түгел һәм деградациянең иң югары нокталары барлыкка килә;RIN кыйммәте РНКның бөтенлеген чагылдыра, 0-10 диапазонында, кыйммәтрәк булса, РНК сыйфаты яхшырак.Хәер, тулылык дәрәҗәсе югарырак.
2) РНК чисталыгы:OD260 / 280 нисбәтен UV спектропотометриясе белән ачыкларга мөмкин.Әгәр OD260 / 280 нисбәте 1,9 белән 2,1 арасында булса, чисталык бик яхшы.
Калдык геном ДНК төгәл булмаган сан нәтиҗәләренә китерергә мөмкин
РНК алынгач, без алган РНК чистартылмаган геном ДНК (gDNA) белән кушылырга мөмкин.Шуңа күрә, кире транскрипциядән соң cDNA да кушылырgDNA.Агым вакытындаqPCRреакция,cDNAһәм gDNA берьюлы көчәйтелергә мөмкин, нәтиҗәдә чагыштырмача кечкенә КТ бәясе барлыкка килә, шуңа күрә нәтиҗәләр икеләтә булырга мөмкин.
Бу очракта без нәрсә эшләргә тиеш?Форгентәкъдим итә:
(1) Кире РНКда геном чистарту эшләрен башкарыгыз, аны РНК чыгару вакытында багана чыгару белән алып була;
(2) Чыгарылган РНКны DNase белән эшкәртегезI , ләкин аны EDTA белән туктату;
кире транскрипция реагентларыгеномны чистарту модульләре белән;

Кире транскрипция өчен праймерларны ничек сайларга?
Кире транскрипция праймерлары кире транскрипция реакциясе нәтиҗәләренә дә тәэсир итә.Экспериментның конкрет шартларына карап кире транскрипция өчен очраклы праймериз, Oligo dT яки генга хас праймерларны сайлый аласыз:
(1) Конкрет транскрипцияләр: генга хас праймериз тәкъдим ителә;
2) Озын фрагмент транскрипцияләре: Oligo dT / генга хас праймериз тәкъдим ителә;
3) Озын сегментлы транскрипцияләрнең эчке кисәкләре: генга хас праймерлар / очраклы праймерлар / очраклы праймерлар + Олиго dT.Киләсе qPCR эксперименты үткәрелсә, Oligo dTны берүзе генә кулланып булмый, чөнки Oligo dT-ны гына куллану 3 ′ бетүгә китерергә мөмкин, бу төгәл булмаган qPCR эксперимент нәтиҗәләренә китерә;
(4) miRNA: Чүпрәле праймерлар яки койрыклы праймерлар кулланылырга мөмкин.

Кире транскрипция продукты cDNA санлаштыру өчен ничә тапкыр эретелергә тиеш?
Кире транскрипция продуктының CDNA алганнан соң, qPCR экспериментлары өчен ничә тапкыр CDNA эретергә кирәк.Әгәр дә CDNA концентрациясе артык югары яки бик түбән булса, көчәйтү эффективлыгы тәэсир итергә мөмкин.CDNA концентрациясен үлчәп буламы, һәм моны ничек эшләргә?
.Бу вакытта кайбер дуслар әйтерләр, мин чистартылганнан соң концентрацияне үлчәрмен;монда, Форген искә төшерергә тели, cDNAны чистартырга киңәш ителми, чөнки кире кайтару белән алынган CDNA озынлыгы төрле, һәм кыска CDNA чистартуда юкка чыгачак.
2) Алайса нәрсә эшләргә?QPCR эксперименты алдыннан, cDNAның эретү градиентын эксперимент алдыннан билгеләргә мөмкин.Мәсәлән: qPCR экспериментлары өчен шаблон буларак cDNA запас чишелешен, 10 тапкыр эретүне һәм 100 тапкыр эретүне кулланыгыз, һәм 18-28 диапазонында CT кыйммәте булган эретү факторын сайлагыз.

МиРНА ничек кире транскрипцияләнергә тиеш?
miRNA - бер полосалы кечкенә молекула РНК, якынча 22 нт зурлыгында, протеин кодламый.Кыска озынлыгы аркасында, гадәти qPCR ысулы аны турыдан-туры бәяләү кыен, шуңа күрә miRNAны киңәйтергә кирәк;miRNA өчен еш кулланыла торган кире транскрипция ысулларына стом-цикл ысулы һәм койрыклау ысулы керә.
Stem-loop ысулы - miRNA-ны киңәйтү.Бу ачыклау ысулы югары сизгерлеккә һәм үзенчәлеккә ия, ләкин ачыклау үткәрү түбән.Бер кире транскрипция бер miRNA һәм эчке сылтаманы гына ачыклый ала;койрык өстәү ысулы икедән тора Бу PolyA полимераз һәм кире транскриптаз булган ике ферментның уртак эше белән тәмамланган.ПолиА полимераз озынлыгын арттыру өчен miRNAга PolyA койрыкларын өстәү өчен җаваплы, һәм кире транскриптаз кире транскрипция реакциясен башкара.Бу ысул югары ачыклау үткәрүчәнлегенә ия һәм бер кире транскрипциядә берничә miRNA һәм эчке сылтамаларны ачыклый ала, ләкин сизгерлек һәм үзенчәлек үзенчәлекле.