PCR - иң киң кулланылган нуклеин кислотасын көчәйтү технологиясе һәм аның сизгерлеге һәм үзенчәлеге аркасында киң кулланыла.Ләкин, PCR кат-кат җылылык денатурациясен таләп итә һәм клиник кыр сынауларында куллануны чикләгән инструментларга һәм җиһазларга таяну чикләреннән котыла алмый.

1990-нчы еллар башыннан күп лабораторияләр җылылык денатурациясен таләп итмәгән даими температураны көчәйтү технологиясен эшли башладылар.Хәзер алар әйләнешле изотермаль көчәйтү технологиясен, чыбыкны алыштыру изотермаль көчәйтү технологиясен, әйләндергеч түгәрәк изотермаль көчәйтү технологиясен һәм нуклеин кислотасы эзлеклелеген эшләделәр.Изотермаль көчәйтү технологиясе һәм башка технологияләр. 

Loop-mediated изотермаль көчәйтү

Көчәйтү принцибы ДНКның динамик тигезлек халәтендә якынча 65 ° C булуына нигезләнә.Теләсә нинди праймер төп парлы булганда һәм ике катлы ДНКның тулыландырылган өлешенә кадәр киңәйтелгәндә, бүтән чыбык аерылачак һәм бер катлы була.

Бу температурада ДНК 4 махсус праймериз куллана, полосага күчерелгән ДНК полимеразына таянып, ДНК синтезын өзлексез әйләндерә.

Башта максатлы генда F3, F2, F1, B1, B2, B3 6 махсус регионны билгеләгез, аннары бу 6 конкрет төбәк нигезендә 4 праймериз эшләгез (астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә):

Алга эчке праймер (FIP) F1c һәм F2 тәшкил итә.

Арткы эчке праймер (BIP) B1c һәм B2 тәшкил итә, һәм TTTT уртасында спасер буларак кулланыла.

Тышкы праймериз F3 һәм B3 максатлы гендагы F3 һәм B3 өлкәләреннән тора.

Лампа реакция системасында эчке праймерның концентрациясе тышкы праймердан берничә тапкыр күбрәк.Эчке праймер башта шаблон полосасы белән берләштерелә, тулы полосаны синтезлау өчен, ДНК икеләтә юлны формалаштыру.Соңыннан, тышкы праймер шаблон полосасы белән кушылып, ДНК икеләтә юлны барлыкка китерә.BstDNA полимеразы тәэсирендә эчке праймер белән синтезланган тулы сызык чыгарыла.Берничә реакциядән соң, бер-берсен тулыландыручы чыбык, ниһаять, дөмбелл структурасы белән бер ДНК полосасын барлыкка китерә.

Дамббелл структурасы ДНКның бер полосасы үзе шаблон буларак кулланыла, ачык очлы ДНК структурасын өзлексез формалаштыру өчен.Эчке һәм тышкы праймериз ДНКның күчмә тамыр-структурасы структурасын өзлексез күчерү һәм киңәйтү реакцияләрен кичерергә юл тота, һәм ниһаять, төрле озынлыктагы берничә тамырлы структура формалаштыра.ДНК катнашмасы.

Loop-арадаш изотермаль көчәйтүнең өстенлекләре һәм кимчелекләре

Лампаның өстенлекләре:

(1) 1 сәгать эчендә максатлы генның 1-10 күчермәсен эффектив көчәйтә алган югары көчәйтү эффективлыгы, көчәйтү эффективлыгы гади PCRныкыннан 10-100 тапкыр күбрәк.

2) Реакция вакыты кыска, үзенчәлеге көчле, һәм махсус җиһаз кирәк түгел.

Лампаның җитешсезлекләре:

(1) Праймерларга таләпләр аеруча зур.

2) көчәйтелгән продуктны клонлаштыру һәм эзләү өчен кулланып булмый, бары тик хөкем өчен генә кулланырга мөмкин.

(3) Көчле сизгерлеге аркасында аэрозоллар ясау җиңел, ялган позитивлар китереп, тест нәтиҗәләренә тәэсир итә.

Sтранс күчерүне көчәйтү

Каты күчерүне көчәйтү (SDA) - витро изотермаль ДНК көчәйтү техникасы, 1992-нче елда Америка галиме Волкер тәкъдим иткән энзиматик реакциягә нигезләнгән.

SDA-ның төп системасы чикләү эндонуклазын, полосаны күчерү активлыгы булган ДНК полимеразын, ике пар праймер, dNTP, кальций һәм магний ионнары һәм буфер системаларын үз эченә ала.

Каты күчерүне көчәйтү принцибы максатчан ДНКның ике очында да химик үзгәртелгән чикләү эндонуклазны тану эзлеклелегенә нигезләнгән.Эндонуклаз танылу урынындагы ДНКдагы бушлыкны ача, һәм ДНК полимеразы 3 ′ бушлыкны киңәйтә һәм киләсе ДНК полосасын алыштыра.

ДНКның алмаштырылган бер полосасы праймериз белән берләштерелергә һәм ДНК полимеразы белән ике юлга сузылырга мөмкин.Бу процесс өзлексез кабатлана, максат эзлеклелеге эффектив көчәйтелә.

Сызуны күчерү технологиясенең өстенлекләре һәм кимчелекләре

SDA өстенлекләре:

Көчәйтү эффективлыгы югары, реакция вакыты кыска, үзенчәлеге көчле, һәм махсус җиһаз кирәк түгел.

SDA җитешсезлекләре:

Продукция бертөрле түгел, һәм кайбер полосалы һәм ике катлы продуктлар һәрвакыт SDA циклында җитештерелә, һәм электрофорез белән ачыклангач койрык котылгысыз булачак.

Rтүгәрәк көчәйтү

Роллинг түгәрәген көчәйтү (RCA) әйләнешле түгәрәк ярдәмендә патогеник организмнардан ДНКны күчерү ысулын кулланып тәкъдим ителә.Бу бер полосалы түгәрәк ДНКны даими температурада шаблон, һәм махсус ДНК полимерасы (Phi29 кебек) куллануны күздә тота, максатлы генның көчәйтелүенә ирешү өчен түгәрәк ДНК синтезы.

RCA сызыклы көчәйтү һәм экспоненциаль көчәйтүгә бүленергә мөмкин.Сызыклы RCA эффективлыгы 10га җитә ала⁵тапкыр, һәм экспоненциаль RCA эффективлыгы 10га җитә ала⁹тапкыр.

Гади аерма, астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә, сызыклы көчәйтү бары тик 1 праймер куллана, экспоненциаль көчәйтү b 2 праймерга ия.

Сызыклы RCA шулай ук ​​бер праймер RCA дип атала.Праймер түгәрәк ДНК белән бәйләнә һәм ДНК полимеразы ярдәмендә киңәйтелә.Продукция - бер цикл озынлыгыннан меңләгән тапкыр кабатланган эзлеклелектә сызыклы бер сызык.

Сызыклы RCA продукты һәрвакыт башлангыч праймер белән бәйләнгәнлектән, сигналны җиңел урнаштыру - зур өстенлек.

Экспоненциаль RCA, шулай ук ​​Hyper таралган көчәйткеч HRCA (Hyper таралган RCA) дип атала, экспоненциаль RCAда, бер праймер RCA продуктын көчәйтә, икенче праймер RCA продукты белән гибридлаштырыла һәм киңәйтелә, һәм алмаштыру инде RCA продукты белән бәйләнгән.

Түгәрәк түгәрәкнең нуклеин кислотасын көчәйтүнең өстенлекләре һәм кимчелекләре

RCA өстенлекләре:

Highгары сизгерлек, яхшы үзенчәлек һәм җиңел эш.

RCA җитешсезлекләре:

Сигналны ачыклау вакытында төп проблемалар.RCA реакциясе вакытында, циркуляцияләнмәгән йозак зонасы һәм ДНК яки РНК шаблоны кайбер фон сигналларын барлыкка китерергә мөмкин. 

Nucleicacid эзлеклелеге нигезендә көчәйтү

Нуклеин кислотасы эзлеклелегенә нигезләнгән көчәйтү (NASBA) - PCR нигезендә эшләнгән яңа технология.Бу өзлексез һәм изотермаль нуклеин кислотасын көчәйтү, T7 промоутер эзлеклелеге белән пар праймерлар белән идарә итү.Технология РНК шаблонын якынча 2 сәгать эчендә якынча 109 тапкыр көчәйтә ала, бу гадәти PCR ысулыннан 1000 тапкыр югарырак һәм махсус җиһазлар таләп итми.

Бу технология авыруларны тиз диагностикалау өчен кулланылды, һәм күпчелек компанияләр хәзерге вакытта РНКны ачыклау комплектларында кулланалар.

РНК көчәйтү шулай ук ​​кире транскрипция PCR технологиясен куллана алса да, NASBAның үз өстенлекләре бар: ул чагыштырмача даими температура шартларында башкарылырга мөмкин, һәм ул традицион PCR технологияләренә караганда тотрыклырак һәм төгәлрәк.

Реакция 41 градус җылылыкта һәм AMV (кош миелобластоз вирусы) кире транскриптаз, RNase H, T7 RNA полимеразы һәм пар праймеризны таләп итә.

Бу процесс нигездә:

Алга праймерда T7 промоутерының тулы эзлеклелеге бар.Реакция вакытында алга праймер РНК полосасына бәйләнә һәм AMV ферменты белән катализатор булып, ДНК-РНК икеле.

RNase H гибрид ике юллы РНКны үзләштерә һәм бер полосалы ДНКны саклый.

Кире праймер һәм AMV ферменты ярдәмендә, T7 промоутер эзлеклелеген үз эченә алган ДНК икеләтә полосасы барлыкка килә.

T7 РНК полимеразы ярдәмендә транскрипция процессы тәмамланды һәм күп санлы РНК җитештерелә.

NASBA өстенлекләре:

(1) Аның праймерында T7 промоутер эзлеклелеге бар, ләкин чит илле ДНКда T7 промоутер эзлеклелеге юк һәм көчәйтелә алмый, шуңа күрә бу технология югары үзенчәлеккә һәм сизгерлеккә ия.

(2) NASBA кире транскрипция процессын көчәйтү реакциясенә турыдан-туры кертә, реакция вакытын кыскарта.

НАСБАның кимчелекләре:

(1) Реакция компонентлары катлаулырак.

2) Реакциянең бәясен күтәрү өчен өч төрле фермент кирәк.