Ct кыйммәте - флюоресцент санлы PCRның иң мөһим нәтиҗә презентациясе формасы.Бу ген белдерү аермаларын яки ген күчермә санын исәпләү өчен кулланыла.Алайса, флюоресенция күләменең Ct бәясе акыллы дип санала?Ct кыйммәтенең эффектив диапазонын ничек тәэмин итәргә?
Ct кыйммәте нәрсә ул?
QPCR көчәйтү процессы вакытында, көчәйтелгән продуктның флуоресцент сигналы билгеләнгән флюоресенция бусагасына җиткәч, тиешле сан көчәйтү цикллары (цикл бусагасы).C - цикл, T - бусага.Гади генә итеп әйткәндә, Ct кыйммәте - башлангыч шаблон көчәйтү qPCR продуктының билгеле күләменә җиткәч туры килгән цикллар саны."Билгеле күләмдә продукт" дип аталганнар соңрак аңлатылачак.
Ct кыйммәте нәрсә эшли?
1. Экспоненциаль көчәйтү, шаблон күләме һәм Ct кыйммәте арасындагы бәйләнеш
Идеаль рәвештә, qPCRдагы геннар билгеле санлы циклдан соң экспоненциаль көчәйтү ярдәмендә туплана.Көчләндерү цикллары саны һәм продуктлар күләме арасындагы бәйләнеш: көчәйтелгән продукт күләме = башлангыч шаблон күләме × (1 + En) цикл саны.Ләкин, qPCR реакциясе һәрвакыт идеаль ситуациядә түгел.Күчерелгән продукт күләме “билгеле бер продукт күләменә” җиткәч, бу вакытта цикллар саны Ct кыйммәте, һәм ул экспоненциаль көчәйтү чорында.Ct кыйммәте һәм башлангыч шаблон күләме арасындагы бәйләнеш: Шаблонның Ct кыйммәте белән шаблонның башлангыч копия номерының логарифмасы арасында сызыклы бәйләнеш бар.Башлангыч шаблон концентрациясе никадәр югары булса, Ct кыйммәте кечерәк;башлангыч шаблон концентрациясе түбән булса, Ct кыйммәте зуррак.
2. Көчләндерү сызыгы, флуоресцент бусагасы һәм билгеле PCR продукт күләме
QPCR көчәйтү продукты күләме турыдан-туры флуоресцент сигнал формасында күрсәтелә, ягъни көчәйтү сызыгы.PCR башлангыч этабында көчәйтү идеаль шартларда, цикллар саны аз, продукт туплау аз, һәм флюоресенция дәрәҗәсен флуоресцент фоннан аерып булмый.Аннан соң, флюоресенция арта һәм экспоненциаль этапка керә.PCR продукты күләме билгеле бер вакытта ачыкланырга мөмкин, PCR реакциясе экспоненциаль этапта булганда, аны "билгеле күләмдә продукт" итеп кулланырга мөмкин, һәм шаблонның башлангыч эчтәлеге моннан чыгарыла ала.Шуңа күрә, билгеле күләмдә продуктка туры килгән флуоресцент сигнал интенсивлыгы - флуоресцент бусагасы.
PCR-ның соңгы этабында көчәйтү сызыгы экспоненциаль көчәйтүне күрсәтми, һәм сызыклы фазага һәм плато фазасына керә.
3. Ct кыйммәтләренең җитештерүчәнлеге
PCR циклы Ct кыйммәтенең цикл санына җиткәч, ул чын экспоненциаль көчәйтү чорына керде.Бу вакытта кечкенә хата көчәйтелмәгән, шуңа күрә Ct кыйммәтенең репродуктивлыгы искиткеч, ягъни бер үк шаблон төрле вакытта яки төрле трубаларда бер үк вакытта көчәйтелә.Көчәйтү, алынган Ct кыйммәте даими.
1.Күпләү эффективлыгы Эн
PCR көчәйтү эффективлыгы полимеразның генны ампликонга әверелдерү эффективлыгын аңлата.Бер ДНК молекуласы ике ДНК молекуласына әверелгәч, көчәйтү эффективлыгы 100% тәшкил итә.Көчләндерү эффективлыгы гадәттә En дип күрсәтелә.Киләсе мәкаләләргә анализ ясау өчен, көчәйтү эффективлыгына йогынты ясаучы факторлар кыскача кертелә.
| Йогынты ясаучы факторлар | аңлату | Ничек хөкем итәргә? |
| A. PCR ингибиторлары | 1. ДНК шаблонында протеиннар яки юу чаралары кебек PCR реакциясен тоткарлаучы матдәләр бар.2. Кире транскрипциядән соң CDNA РНК яки ТР реагент компонентларының югары концентрациясен үз эченә ала, алар киләсе PCR реакциясен дә тыя ала. | 1. Пычрату бармы-юкмы, A260 / A280 һәм A260 / A230 яки РНК электрофорезы нисбәтен үлчәп бәяләргә мөмкин.2. CDNA кире транскрипциядән соң билгеле бер катнашу буенча эретелгәнме. |
| B. Дөрес булмаган праймериз | Праймерлар эффектив янмыйлар | Праймерларны пример-димерлар яки чәчләр, туры килмәүләр, кайвакыт интроник конструкцияләр өчен тикшерегез. |
| C. PCR реакция программасының дизайны | 1. Праймерлар эффектив ябыштыра алмыйлар2. ДНК полимеразының чыгарылуы җитәрлек түгел 3. Озак вакытлы югары температуралы ДНК полимераз активлыгы кимеде | 1. Аннальинг температурасы праймерның ТМ кыйммәтеннән югарырак2. Денатурациягә кадәр вакыт бик кыска 3. Реакция процедурасының һәр этабының вакыты бик озын |
| D. Реагентларның катнашуы яки пипетинг хаталары | Реакция системасында PCR реакция компонентларының җирле концентрациясе артык югары яки тигез түгел, нәтиҗәдә PCR көчәйтүнең экспоненциаль булмаган көчәйтелүенә китерә. | |
| Э. Ампликон озынлыгы | Ампликонның озынлыгы бик озын, 300 ат көченнән артып китә, көчәйтү эффективлыгы түбән | Ампликон озынлыгы 80-300bp арасында булуын тикшерегез |
| F. qPCR реагентларының йогынтысы | Реагенттагы ДНК полимеразының концентрациясе түбән яки буфердагы ион концентрациясе оптимальләштерелмәгән, нәтиҗәдә Так ферментлары активлыгы максимумга җитмәгән. | Стандарт сызык буенча көчәйтү эффективлыгын билгеләү |
2. Ct кыйммәтләре диапазоны
Ct кыйммәтләре 15-35 арасында.Әгәр дә Ct бәясе 15тән ким булса, көчәйтү төп чор диапазонында һәм флюоресенция бусагасына ирешелмәгән дип санала.Идеаль рәвештә, Ct кыйммәте белән шаблонның башлангыч күчермә номерының логарифмасы арасында сызыклы бәйләнеш бар, ягъни стандарт сызык.Стандарт сызык аша, көчәйтү эффективлыгы 100% булганда, генның бер копия санын бәяләү өчен исәпләнгән Ct бәясе 35 тирәсе. Әгәр дә ул 35тән артса, шаблонның башлангыч күчермә саны теоретик яктан 1дән ким, бу мәгънәсез дип саналырга мөмкин.
Төрле Ct диапазоннары өчен, ген копия санының аермасы һәм башлангыч шаблон күләмендәге көчәйтү эффективлыгы аркасында, ген өчен стандарт сызык ясарга һәм генның сызыклы ачыклау диапазонын исәпләргә кирәк.
3. Ct кыйммәтенең йогынты ясаучы факторлары
Көчәйтү цикллары саны һәм продукт күләме арасындагы бәйләнештән: көчәйтелгән продукт күләме = башлангыч шаблон күләме × (1 + En) цикл саны, идеаль шартларда башлангыч шаблон һәм En Ct кыйммәтенә тискәре йогынты ясавын күреп була.Шаблон сыйфаты яки көчәйтү эффективлыгындагы аерма Ct кыйммәтенең артык зур яки бик кечкенә булуына китерәчәк.
4.Кт бәясе бик зур яки бик кечкенә
Пост вакыты: 22-2023 февраль
