Молекуляр диагностика технологиясе молекуляр биология ысулларын куллана, кеше организмының һәм төрле патогеннарның генетик материалының чагылышын һәм структурасын ачыклау, авыруларны фаразлау һәм диагностикалау максатына ирешү өчен.

Соңгы елларда молекуляр диагностика технологиясен яңарту һәм кабатлау белән молекуляр диагностиканың клиник кулланылышы киңәя һәм тирәнәя, молекуляр диагностика базары тиз үсеш чорына керә.

Автор базардагы гомуми молекуляр диагностика технологияләренә йомгак ясый һәм өч өлешкә бүленә: беренче өлеше PCR технологиясен, икенче өлеше нуклеин кислотасын изотермаль көчәйтү технологиясен, икенче өлеше эзләү технологиясен кертә.

01

I өлеш: PCR технологиясе

PCR технологиясе

PCR (полимераз чылбыр реакциясе) - витро ДНК көчәйтү технологияләренең берсе, 30 елдан артык тарихы бар.

PCR технологиясе 1983-нче елда АКШның etетус шәһәреннән Кэри Маллис тарафыннан пионер булып хезмәт итә.Маллис 1985-нче елда PCR патентына гариза биргән һәм шул ук елда Фән буенча беренче PCR академик кәгазен бастырган.Муллис 1993 елда Химия буенча Нобель премиясенә лаек булды.

PCR төп принциплары

PCR максатчан ДНК фрагментларын миллионнан артык тапкыр көчәйтә ала.Принцип шунда: ДНК полимеразы катализы астында, төп ДНК шаблон, һәм киңәйтү өчен башлангыч пример кулланыла.Ул витрода денатурация, аннальинг һәм киңәйтү кебек адымнар аша кабатлана.ДНК процессы ата-ана шаблоны ДНКны тулыландыра.

Стандарт PCR процессы өч этапка бүленә:

1. Денатурация: ДНКның ике юлын аеру өчен югары температураны кулланыгыз.ДНКның ике катлы водород бәйләнеше югары температурада (93-98 ° C) өзелә.

2. Аннальинг: Ике катлы ДНК аерылганнан соң, температура түбәнәйтелә, праймер бер полосалы ДНК белән бәйләнә ала.

3. Киңәйтү: ДНК полимеразасы температура төшкәндә бәйләнгән праймериздан ДНК полосалары буенча тулыландырылган полосаларны синтезлый башлый.Озайту тәмамлангач, цикл тәмамлана, һәм ДНК фрагментлары саны икеләтә арта.

Бу өч адымны 25-35 тапкыр кабатлап, ДНК фрагментлары саны тиз артачак.

PCR-ның тапкырлыгы шунда ки, төрле праймерлар төрле максатлы геннар өчен эшләнергә мөмкин, шулай итеп максатлы ген фрагментлары кыска вакыт эчендә көчәйтелә ала.

Әлегә PCRны өч категориягә бүлеп була: гади PCR, флуоресцент санлы PCR һәм санлы PCR.

Гади PCRның беренче буыны

Максатлы генны көчәйтү өчен гади PCR көчәйтү коралын кулланыгыз, аннары продуктны табу өчен агароза гели электрофорезын кулланыгыз, бары тик сыйфатлы анализ ясарга мөмкин.

Беренче буын PCR-ның төп кимчелекләре:

- Конкрет булмаган көчәйтү һәм ялган уңай нәтиҗәләргә омтылу.

- Ачыклау озак вакыт ала һәм операция авыр.

- Бердәнбер сыйфатлы тест үткәрергә мөмкин.

Икенче буын флюоресенция санлы PCR

Флуоресцент санлы PCR (Real-Time PCR), шулай ук ​​qPCR дип атала, реакция системасының барышын күрсәтә ала торган флуоресцент тикшерүләр өстәп, көчәйтелгән продуктларның туплануын күзәтү өчен кулланыла, һәм нәтиҗәләрне флуоресцент сызык аша хөкем итә, һәм аны Cq кыйммәте һәм стандарт сызык ярдәмендә бәяләргә мөмкин.

QPCR технологиясе ябык системада алып барылганга, пычрану ихтималы кими, һәм флюоресенция сигналын санлы ачыклау өчен күзәтеп була, шуңа күрә ул клиник практикада иң киң кулланыла һәм PCR-ның өстенлекле технологиясенә әверелә.

Реаль вакыттагы флуоресцент санлы PCRда кулланылган флуоресцент матдәләргә бүлеп була: TaqMan флуоресцент зоналары, молекуляр маяклар һәм флуоресцент буяулар.

1) TaqMan флуоресцент тикшерү:

PCR көчәйтү вакытында пар праймерлар өстәгәндә билгеле бер флуоресцент зонасы өстәлә.Прибор - олигонуклеотид, һәм ике очка тиешенчә хәбәрче флуоресцент төркеме һәм сүндергеч флуоресцент төркеме язылган.

Прибор тотрыксыз булганда, хәбәрче төркеме чыгарган флуоресцент сигнал сүндерү төркеме тарафыннан үзләштерелә;PCR көчәйтү вакытында, Так ферментының 5′-3 ′ экзонуклази активлыгы тикшерелә һәм деградацияләнә, хәбәрче флуоресцент группа һәм сүндергеч ясый Флуоресцент төркем аерыла, шулай итеп флуоресцент мониторинг системасы флюоресенция сигналын ала ала, ягъни ДНК полосасы көчәйтелгәндә, флюоресцент сигналның туплануы.

2) SYBR флюоресцент буяулар:

PCR реакция системасында артык SYBR флюоресцент буяу өстәлә.SYBR флюоресцент буяу махсус ДНКга кертелмәгәннән соң, ул флуоресцент сигнал чыгара.Чылбырга кертелмәгән SYBR буяу молекуласы бернинди флуоресцент сигнал да чыгармый, шуның белән флуоресцент сигналны тәэмин итә PCR продуктларының артуы PCR продуктларының артуы белән тулысынча синхронлаша.SYBR ике катлы ДНК белән генә бәйләнә, шуңа күрә эретү сызыгы PCR реакциясенең конкрет булуын ачыклау өчен кулланылырга мөмкин.

3) Молекуляр маяклар

Бу 5 һәм 3 очында якынча 8 база чәч структурасын формалаштыручы, икеле маркалы олигонуклеотид зонасы.Ике очындагы нуклеин кислотасы эзлеклелеге бер-берсенә бәйләнгән, флуоресцент группа һәм сүндерү төркеме тыгыз булырга мөмкин.Якын, ул флюоресенция китермәячәк.

PCR продукты барлыкка килгәннән соң, анналь процесс вакытында молекуляр маякның урта өлеше билгеле бер ДНК эзлеклелеге белән парлаштырылган, һәм флуоресцент ген флюоресенция чыгару өчен сүндергеч геннан аерылган.

Икенче буын PCR-ның төп кимчелекләре:

Сәнгатьчәнлек әле җитми, аз күчермәле үрнәкләрне табу төгәл түгел.

Фон кыйммәтенең йогынтысы бар, һәм нәтиҗә комачаулый.

Өченче буын санлы PCR

Санлы PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) максат ноктасының күчерелмә санын соңгы ноктаны ачыклау аша исәпли, һәм эчке контроль һәм стандарт кәкреләр кулланмыйча төгәл абсолют санны ачыклый ала.

Санлы PCR соңгы ноктаны ачыклауны куллана һәм Ct кыйммәтенә (цикл бусагасына) бәйле түгел, шуңа күрә санлы PCR реакциясе көчәйтү эффективлыгына азрак тәэсир итә, һәм PCR реакция ингибиторларына толерантлык яхшыра, югары төгәллек һәм репродуктивлык белән.

Highгары сизгерлек һәм югары төгәллек характеристикалары аркасында, ул PCR реакция ингибиторларына җиңел комачауламый, һәм ул тикшерү һәм куллану ноктасына әверелгән стандарт продуктларсыз чын абсолют санлашуга ирешә ала.

Реакция берәмлегенең төрле формалары буенча аны өч төргә бүлеп була: микрофлуид, чип һәм тамчы системалары.