QPCR экспериментларында праймериз дизайны да бик мөһим сылтама.Праймерлар яраклымы, көчәйтү эффективлыгы стандартка җитәме, көчәйтелгән продуктлар конкретмы, эксперименталь нәтиҗәләр бармы-юкмы белән тыгыз бәйләнгән.
Шулай итеп, qPCR пример үзенчәлеген ничек яхшырак ясарга?Amгары көчәйтү эффективлыгы?
Бүген без сезне qPCR праймеризын бергә эшләргә алып барырбыз, һәм qPCR праймериз дизайны экспериментларда эффектив осталыкка әйләнсен.
QPCR праймерларын эшләгәндә, гадәттә, түбәндәге пунктларга игътибар итегез: праймерлар мөмкин кадәр интроннар аша эшләнергә тиеш, продукт озынлыгы 100-300 ат көченә, Tm бәясе мөмкин кадәр 60 ° C ка якын булырга тиеш, һәм агым һәм аскы праймерлар мөмкин кадәр якын булырга тиеш, һәм праймерның ахыры G яки C булырга тиеш.
1. Эчтәлекле праймериз дизайны
QPCR праймерларын эшләгәндә, интроннар аша эшләнгән праймерларны сайлау gDNA шаблонын көчәйтергә комачаулый ала, һәм продуктлар барысы да cDNA көчәйтүеннән алынган, шулай итеп gDNA пычрану тәэсирен бетерә.
2. Праймер озынлыгы
Праймер озынлыгы, гадәттә, 18-30 нт арасында, һәм көчәйтү продуктының озынлыгы мөмкин кадәр 100-300 ат көченә контрольдә тотылырга тиеш.
Праймер бик кыска булса, ул специаль булмаган көчәйтүгә китерәчәк, һәм ул озын булса, җиңел икенчел структураны барлыкка китерәчәк (мәсәлән, чәч структурасы).Әгәр дә көчәйтү продукты бик озын булса, ул полимераз реакциясе өчен яраксыз, бу PCR көчәйтү эффективлыгына тәэсир итәчәк.
3. GC эчтәлеге һәм Tm кыйммәте
Праймерларның GC эчтәлеге 40% белән 60% арасында контрольдә тотылырга тиеш.Әгәр дә ул бик югары яки артык түбән булса, реакция башлау өчен уңайлы түгел.Алга һәм кире праймерларның GC эчтәлеге бер үк Tm кыйммәтен һәм аннальинг температурасын алу өчен бер үк якын булырга тиеш.
Tm бәясе мөмкин кадәр 55-65 ° C арасында булырга тиеш, гадәттә 60 ° C, һәм агым һәм агымның Tm бәясе мөмкин кадәр якын булырга тиеш, яхшырак 4 ° C-тан артмаска тиеш.
4. Праймерның 3 ′ очында А сайлаудан сакланыгыз
Праймерның 3 ′ очлары туры килмәгәндә, төрле нигезләрнең синтез эффективлыгында зур аермалар бар.Соңгы база А булганда, ул туры килмәгән очракта да чылбыр синтезын башлап җибәрә ала, һәм соңгы база T булганда, туры килмәгән индукциянең эффективлыгы сизелерлек кими.Шуңа күрә, праймерның 3 ′ очында А сайлаудан сакланырга тырышыгыз, һәм Тны сайлау яхшырак.
Әгәр дә ул праймериз булса, тикшерүнең 5 ′ очлары G була алмый, чөнки бер G базасы FAM флюоресцент хәбәрче төркеменә тоташканда да, G шулай ук ​​FAM төркеме чыгарган флуоресцент сигналны сүндерә ала, бу ялган тискәре нәтиҗәләргә китерә.Күренү.
5. Базаны бүлү
Праймердагы дүрт базаны бүлү яхшырак, очраклы, 3 ′ ахырында G яки C 3, һәм 3 рәттән артык.G яки C GC бай эзлеклелектә парлашу җиңел.
6. Праймер дизайн өлкәсе катлаулы икенчел структуралардан сакланырга тиеш.
Көчәйтү продуктының бер сызыгы белән формалашкан икенчел структура PCR-ның шома алгарышына тәэсир итәчәк.Максатлы эзлеклелектә икенчел структура барлыгын алдан әйтеп, праймериз дизайнында бу төбәктән сакланырга тырышыгыз.
7. Праймерлар үзләре дә, праймерлар арасында бер-берсен тулыландыручы нигезләрдән сакланырга тырышырга тиеш.
Праймерның үзе белән праймер арасында эзлекле 4 төп комплект була алмый.Праймерның бер-берсен тулыландыручы эзлеклелеге булырга тиеш түгел, югыйсә ул үзен катырып, чәч структурасын формалаштырачак, бу праймер һәм шаблонның аннальләштерү комбинациясенә тәэсир итәчәк.
Өстәмә эзлеклелек агым һәм агымдагы праймерлар арасында була алмый.Праймерлар арасындагы тулыландыру пример үлчәмнәрен китерәчәк, бу PCR эффективлыгын киметәчәк һәм хәтта сан төгәллегенә тәэсир итәчәк.Әгәр праймер-димер һәм чәч структуралары котылгысыз булса, △ G бәясе артык югары булырга тиеш түгел (4,5 ккал / молдан ким булырга тиеш).
8. Праймерлар максатчан продуктны көчәйтәләр.
QPCR ачыклауның төп максаты - максатлы генның күплеген аңлау.Конкрет булмаган көчәйтү очраклары килеп чыкса, санлаштыру дөрес булмас.Шуңа күрә, праймериз эшләнгәннән соң, аларны BLAST сынап карарга кирәк, һәм продуктларның үзенчәлеге эзлеклелек базасында чагыштырыла.
Алга таба, без QPCR праймерларын проектлау өчен мисал итеп кеше GAS6 (үсешне кулга алу 6) генын алабыз.
01 сорау ген
Homo GAS6NCBI аша.Монда без ген исемен һәм төрләрен чагыштыруга игътибар итергә тиеш, аларның эзлекле булуын.
02 Ген эзлеклелеген табыгыз
(1) Әгәр максатчан эзлеклелек геном ДНК булса, беренчесен сайлагыз, бу генның геном ДНК эзлеклелеге.
(2) Максатлы эзлеклелек mRNA булса, икенчесен сайлагыз.Кергәннән соң, астагы таблицада "CDS" басыгыз.Көчле фон эзлеклелеге - генның кодлаштыру эзлеклелеге.
03 Дизайн праймериз
Primer-BLAST интерфейсын кертегез
Ген эзлеклелеге номерын яки Fasta форматындагы эзлеклелекне өске сул якка кертегез һәм тиешле параметрларны тутырыгыз.

"Праймер алыгыз" төймәсенә басыгыз һәм NCBI пәйда булачак, сезгә мондый параметр сайлау бүтән бүленү вариантларына көчәйтеләчәк.Без төрле бүленү вариантларын тикшерә алабыз һәм тиешле пример парларын алу өчен җибәрә алабыз (астагы рәсемдә күрсәтелгәнчә).Бу процесс эшләү өчен дистәләгән секунд кирәк булырга мөмкин.
Бу пример парларының аннальинг температурасы барысы 60 ° C.Экспериментның максаты буенча, уртача озынлыктагы, яхшы спецификацияле һәм эксперимент өчен праймерларны азрак тулыландыручы праймерларны сайлагыз, һәм уңыш дәрәҗәсе бик югары!
04Пример үзенчәлеген тикшерү
Чынлыкта, праймерларны проектлаудан тыш, Пример-Бласт без үзебез ясаган праймерларны бәяли ала.Праймер дизайн битенә кире кайтыгыз, без эшләгән югары һәм агымдагы праймерларны кертегез, һәм башка параметрлар көйләнмәячәк.Тапшырганнан соң, сез парларның башка геннарда да барлыгын күрә аласыз.Аларның барысы да без көчәйтергә теләгән генда күрсәтелсә, бу пар праймерларның үзенчәлеге бик яхшы!(Мәсәлән, бу праймериз соравының бердәнбер нәтиҗәсе!)

05 Сыйфатның төп бәясе
"Стандартка кадәр көчәйтү эффективлыгын", "көчәйтелгән продукт характеристикаларын" һәм "ышанычлы эксперименталь нәтиҗәләрне" берләштергән "камил" праймер нинди пример?
Көчләндерү эффективлыгы

эретү сызыгы
Праймерларның көчәйтү эффективлыгы 90% -110% ка җитә, димәк, көчәйтү эффективлыгы яхшы, һәм эретү сызыгы бер биеклеккә ия һәм гадәттә Tm> 80 ° C, димәк, көчәйтү үзенчәлеге яхшы.
 
Бәйләнешле продуктлар:
Реаль Вакыт PCR җиңел - SYBR Яшел I.
Реаль Вакыт PCR Easyиңел-Такман