Праймериз нигезе (99% проблемалар чишелергә мөмкин)

1. Праймер озынлыгы: Дәреслек 15-30bp таләп итә, гадәттә 20bp.Конкретлыкны тәэмин итү өчен фактик шарт 18-24bp булу яхшырак, ләкин озынрак, озын пример үзенчәлекне киметәчәк, уңышны киметәчәк.

2. Пример көчәйтү вакыты: 200-500bp урынлы, һәм фрагментны билгеле шартларда 10 кбга кадәр киңәйтергә мөмкин.

3. Праймер базасы: G + C эчтәлеге 40-60% булырга тиеш, бик аз G + C көчәйтү эффекты яхшы түгел, артык G + C специфик булмаган полосаларда күренү җиңел.ATGC 5-дән артык пурин яки пиримидин нуклеотид кластерларыннан сакланып, очраклы рәвештә таратыла.5 ′ ахыры һәм арадаш эзлеклелеге өчен мульти-гк, тотрыклылыкны арттыру, 3 ′ очында бай GCдан саклану, соңгы 3 база өчен GC юк, яки соңгы 5 базаның 3 өчен GC юк.

4. Праймерларда икенчел структурадан сакланыгыз, һәм ике праймер арасында тулыландырудан сакланыгыз, аеруча 3 'ахырында тулыландыру, югыйсә пример димеры барлыкка киләчәк һәм специаль булмаган көчәйтелгән полосалар барлыкка киләчәк.

5. Праймерларның 3 'очындагы нигезләр, аеруча соңгы һәм соңгы нигезләр, параллель булмаган терминал нигезләре аркасында PCR уңышсызлыгын булдырмас өчен катгый парлаштырылырга тиеш.

6. Праймерлар тиешле ярылу урыннары белән яисә өстәлергә мөмкин, һәм көчәйтелгән максат эзлеклелеге яхшырак ярылу урыннары булырга тиеш, бу ярылу анализы яки молекуляр клонлау өчен бик файдалы.

7. Праймерларның үзенчәлеге: праймерларның нуклеин кислотасы эзлеклелеге базасында башка эзлеклелектә ачык гомология булырга тиеш түгел.

8. Программаны кулланырга өйрәнегез: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Бу онлайн дизайн иң яхшы эшли).

Aboveгарыдагы эчтәлек дизайн проблемаларының ким дигәндә 99% чишә ала.

Праймер дизайнының детальләрен контрольдә тоту

1. Праймер озынлыгы

Гомуми праймер озынлыгы 18 ~ 30 нигез.Гомумән алганда, праймерның аннальинг температурасын билгеләүче иң мөһим фактор - праймерның озынлыгы.Праймерның аннальинг температурасы гадәттә сайланган (Tm кыйммәте -5 ℃), һәм кайберләре турыдан-туры Tm кыйммәтен кулланалар.Праймерларның аннальинг температурасын якынча исәпләү өчен түбәндәге формулалар кулланылырга мөмкин.

Праймерның озынлыгы 20bp-тан ким булганда: [4 (G + C) +2 (A + T)] - 5 ℃

Праймерның озынлыгы 20bp-тан зуррак булганда: 62,3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / озынлык-5 ℃

Моннан тыш, күпчелек программалар шулай ук ​​аннальинг температурасын исәпләү өчен кулланылырга мөмкин, исәпләү принцибы төрле булыр, шуңа күрә кайвакыт исәпләнгән кыйммәт кечкенә аерма булырга мөмкин.PCR реакцияләрен оптимальләштерү өчен, иң яхшы эффективлык һәм спецификация өчен 54 less ким булмаган температураны тәэмин итүче иң кыска праймерлар кулланыла.

Гомумән алганда, примерның үзенчәлеге һәр өстәмә нуклеотид өчен дүрт факторга арта, шуңа күрә күпчелек кушымталар өчен минималь озынлык 18 нуклеотид була.Праймер озынлыгының югары чиге бик мөһим түгел, нигездә реакция эффективлыгы белән бәйле.Энтропия аркасында, праймер озынрак булса, ДНК полимеразын бәйләү өчен тотрыклы ике катлы шаблон формалаштыру өчен, максатлы ДНК белән бәйләү тизлеге түбәнрәк.

Праймерларны проектлау өчен программа тәэминаты кулланганда, праймерларның озынлыгы үз чиратында ТМ бәясе белән билгеләнергә мөмкин, аеруча флуоресцент санлы PCR, TM = 60 ℃ яки шулай итеп контрольдә тотылырга тиеш.

2.GC эчтәлеге

Гадәттә, пример эзлеклелегендә G + C эчтәлеге 40% ~ 60%, һәм пар примерның GC эчтәлеге һәм Tm бәясе координацияләнергә тиеш.Әгәр праймерның җитди GC яки AT тенденциясе булса, праймерның 5 'очына тиешле күләмдә A, T яки G һәм C койрыгы кушылырга мөмкин.

3. Температура

Аннальинг температурасы чылбырсыз температурадан 5 ℃ түбән булырга тиеш.Әгәр праймер базлары саны аз булса, аннальинг температурасы тиешенчә күтәрелергә мөмкин, бу PCR үзенчәлеген арттырырга мөмкин.Әгәр базалар саны күп булса, аннальинг температурасы тиешенчә киметелергә мөмкин.4 ℃ ~ 6 prim примерлар арасындагы аннальинг температурасы аермасы PCR уңышына тәэсир итмәячәк, ләкин идеаль рәвештә пар примерларның аннальинг температурасы бер үк, алар 55 ℃ ~ 75 between арасында үзгәрергә мөмкин.

4. Көчәйтү шаблонының икенчел структурасы өлкәсеннән сакланыгыз

Күчерелгән фрагментны сайлаганда шаблонның икенчел структурасы өлкәсеннән саклану яхшырак.Максатлы фрагментның тотрыклы икенчел структурасы шаблон сайлау өчен файдалы булган компьютер программалары белән алдан әйтелергә һәм бәяләнергә мөмкин.Эксперименталь нәтиҗәләр шуны күрсәтә: киңәйтелергә тиешле төбәкнең ирекле энергиясе (△ G) 58,6lkJ / молдан ким булганда киңәйтү еш уңышсыз була.

5. Максатлы ДНК белән туры килмәү

Күчерелгән максатлы ДНК эзлеклелеге зур булганда, праймер максатлы ДНКның берничә өлешенә бәйләнергә мөмкин, нәтиҗәдә берничә полоса барлыкка килә.Бу юлы BLAST программа тестын, вебсайтны кулланырга кирәк:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Ике эзлеклелекне тигезләгез (bl2seq).

Праймер эзлеклелеген 1 зонага ябыштыру һәм ДНК эзлеклелеген 2 зонага алыштыру алышынырга мөмкин, һәм BLAST тулыландыргыч, антисенс һәм башка мөмкинлекләрне исәпли, шуңа күрә кулланучыларга ике чылбырның да чылбыр булуын сизергә кирәк түгел.Сез шулай ук ​​GI номерын кертә аласыз, мәгълүмат базасында эзлеклелекнең GI номерын белсәгез, эзлеклелекнең зур өлешен ябыштырырга кирәкми.Ниһаять, максатлы ДНКда праймерның берничә гомологик сайты бармы-юкмы икәнен 3-нче тигезләү төймәсенә басыгыз.

6. Праймер терминалы

Праймерның 3 'ахыры - киңәйтү башланган урында, шуңа туры килмәүдән башларга кирәк.3 'ахыры 3 эзлекле G яки C дан артмаска тиеш, чөнки бу праймерны G + C баету эзлеклелеге өлкәсендә ялгыш этәрүгә китерәчәк.3 'ахыры бернинди икенчел структура формалаштыра алмый, махсус PCR (AS-PCR) реакцияләреннән кала, праймерның 3 ′ очын туры китереп булмый.Мисал өчен, кодлау өлкәсе көчәйтелгән булса, 3 'праймерның ахыры кодның өченче позициясендә туктатылырга тиеш түгел, чөнки кодның өченче позициясе бозылырга мөмкин, бу көчәйтүнең үзенчәлегенә һәм эффективлыгына тәэсир итәчәк.Аннексия праймерларын кулланганда, кодон куллану таблицасына мөрәҗәгать итегез, биологик өстенлеккә игътибар итегез, 3 ′ ахырында аннексия праймерларын кулланмагыз, һәм примерларның югары концентрациясен кулланыгыз (1uM-3uM).

7. Праймерларның икенчел структурасы

Праймерларның үзләре бер-берсен тулыландыручы эзлеклелектә булырга тиеш түгел, югыйсә праймерлар үзләре чәч структураларына бөкләнәчәкләр, һәм бу икенчел структура стерик киртәләр аркасында праймерлар һәм шаблоннарның бәйләнешенә тәэсир итәчәк.Ясалма хөкем кулланылса, праймерларның өзлексез тулыландыручы нигезләре 3bp-тан зур булырга тиеш түгел.Ике праймер арасында бер-берсен тулыландыручы булырга тиеш түгел, аеруча пример үлчәмнәре барлыкка килмәсен өчен, 3 'очын тулыландыручы капланудан сакланырга кирәк.Гомумән алганда, бер-бер артлы 4 эзлекле гомология яки тулыландыру булырга тиеш түгел.

8. Маркерлар яки локи өстәргә

5 'ахыры көчәйтү үзенчәлегенә аз тәэсир итә, шуңа күрә көчәйтү үзенчәлегенә тәэсир итмичә үзгәртелергә мөмкин.Праймер 5 'ахырына модификация кертелгән: ферментларны чикләү сайтын өстәү;Билгеләнгән биотин, флуоресцент, дигоксин, Eu3 + һ.б. ДНК эзлеклелеген бәйләүче протеин кертү;Мутация сайтлары белән таныштыру, мутация эзлеклелеген кертү һәм югалту, промоутер эзлеклелеген кертү һ.б.Максатлы эзлеклелектә булмаган өстәмә эзлеклелек, чикләү сайтлары һәм промоутер эзлеклелеге кебек, праймерның 5 ′ очына спецификациягә тәэсир итмичә өстәргә мөмкин.Бу эзлеклелек ТМ кыйммәтләрен исәпләүгә кертелмәгән, ләкин тулыландыру һәм эчке икенчел структура өчен сыналырга тиеш.

9. Субклоннар

Күпчелек очракта, PCR беренчел клонлаштыру гына, аннары безгә максат фрагментын төрле векторларга бүлеп куярга кирәк, шуңа күрә PCR адымында киләсе операция өчен өстәмә нигезләр эшләргә кирәк.

Субклонлау өчен эшләнгән кайбер эзлеклелектә түбәндә йомгак ясала.
Эндонуклазны чикләү сайты өстәлде

Ферментларны чикләү сайтларын өстәү - PCR продуктларын төркемләү өчен иң еш кулланыла торган ысул.Гадәттә, ярылу мәйданы алты нигез, ярылу мәйданының 5 'очына өстәп, 2 ~ 3 саклагыч база өстәргә кирәк.Ләкин, төрле ферментлар таләп иткән саклагыч базалар саны төрле.Мәсәлән, SalⅠ саклагыч база таләп итми, EcoRⅤ 1 саклагыч база таләп итә, NotⅠ 2 саклагыч база таләп итә, һәм Hind 3 3 саклагыч база таләп итә.

LIC койрык өсти

LIC-ның тулы исеме - Ligation-Independent клонлаштыру, Навоген тарафыннан махсус PET векторы өчен уйлап чыгарылган клонлаштыру ысулы.LIC ысулы белән әзерләнгән PET ташучы тулы булмаган 12-15 төп ​​бер катлы ябыштыргыч очларга ия, алар максатлы кертү фрагментына туры килгән ябыштыргыч очларны тулыландыралар.Көчәйтү максатыннан, кертелгән фрагментның пример 5 ′ эзлеклелеге LIC векторын тулыландырырга тиеш.T4 ДНК полимеразының 3 ′ → 5 ′ экстракт активлыгы кыска вакыттан соң кертелгән фрагментта бер катлы ябыштыргыч оч ясарга мөмкин.Продукция әзерләнгән фрагментны һәм векторны үзара аннальләштерүдән генә барлыкка килергә мөмкин, бу ысул бик тиз һәм эффектив, һәм ул клонлаштыруга юнәлтелгән.
ТА клоны койрык өсти
TA клонировкасы фрагментны векторга юнәлтә алмады, соңрак Invitrogen клонлаштыруны максат итә торган вектор кертте, аның бер очында дүрт күренекле GTGGS булган.Шуңа күрә, PCR праймериз дизайнында, фрагментлар "юнәлешле" булсын өчен, өстәмә эзлеклелек өстәлергә тиеш.

Әгәр дә сез вакытыгыз кыска булса, сез генны вектор белән берләштереп, туры синтезны кулланып карый аласыз, без мутекуляристларда ET ген синтезы дип атыйбыз.

D. In-Fusion клонлау ысулы

Лига кирәк түгел, озак реакция кирәк түгел.Сызыклы векторның ике очында да эзлеклелек кертелсә, праймериз дизайнында PCR продукты һәм сызыклы вектор BSA булган кушылу фермент эремәсенә кушылып, ярты сәгать бүлмә температурасында урнаштырылса, трансформация үткәрелергә мөмкин.Бу ысул аеруча зур күләмле конверсия өчен яраклы.

10. Праймерны берләштерү

Кайвакыт, пример дизайны турында чикләнгән эзлеклелек турында мәгълүмат кына билгеле.Мәсәлән, аминокислота эзлеклелеге генә билгеле булса, кушылу праймеры эшләнергә мөмкин.Кушылу праймеры - бер төрле аминокислотаны кодлаган төрле төп мөмкинлекләрне күрсәтүче төрле эзлеклелектә катнашма.Specзенчәлекне арттыру өчен, сез төрле организмнарның төп куллану өстенлекләре буенча аннексияне киметү өчен кодон куллану таблицасына мөрәҗәгать итә аласыз.Гипоксантин праймерның анналь температурасын киметү өчен барлык нигезләр белән парлаштырылырга мөмкин.Кушымта нигезләрен праймерның 3 ′ очында кулланмагыз, чөнки соңгы 3 нигезне 3 ′ очында аннальләштерү PCRны дөрес булмаган урында башлау өчен җитә.Primгары пример концентрацияләре (1μM - 3μM) кулланыла, чөнки күпчелек аннексия катнашмаларындагы праймерлар максат шаблонына хас түгел.

PCR чималыконтроль

1. Төп сан

Eachәр праймерның концентрациясе 0,1 ~ 1умол яки 10 ~ 100pmol.Иң аз праймер белән кирәкле нәтиҗә ясау яхшырак.Праймерның югары концентрациясе туры килмәүгә һәм специаль булмаган көчәйтүгә китерәчәк, һәм праймерлар арасында үлчәмнәр формалаштыру мөмкинлеген арттырачак.

2. Пример концентрациясе

Праймерларның концентрациясе үзенчәлеккә тәэсир итә.Оптималь пример концентрациясе гадәттә 0,1 - 0,5μМ арасында.Primгары пример концентрацияләре билгеле булмаган продуктларның көчәйтелүенә китерә.

3. Праймерның температурасы

Праймерлар өчен тагын бер мөһим параметр - эрү температурасы (ТМ).Бу температура, праймерларның 50% һәм тулыландыргыч эзлеклелек ике катлы ДНК молекулалары итеп күрсәтелгәндә.Tm PCR аннальинг температурасын куярга тиеш.Идеаль рәвештә, аннальинг температурасы максатчан эзлеклелектә примерларның эффектив аннальләшүен тәэмин итәр өчен җитәрлек дәрәҗәдә түбән, ләкин билгеле булмаган бәйләнешне киметү өчен җитәрлек югары.Акыллы аннальинг температурасы 55 ℃ - 70 from.Анналь температурасы, гадәттә, ТМ праймерыннан 5 ℃ түбән куелган.

Tm көйләү өчен берничә формула бар, алар кулланылган формулага һәм праймерлар эзлеклелегенә карап бик нык үзгәрәләр.Күпчелек формулалар якынча Tm кыйммәтен тәэмин иткәнгә, барлык температуралар башлангыч нокта гына.Specзенчәлекне аннальинг температурасын әкренләп күтәрә торган берничә реакцияне анализлап яхшыртырга мөмкин.Фаразланган Tm-5 below астыннан башлап, әкренләп 2 of арту температурасын күтәрегез.Higherгары анналь температура пример үлчәмнәре һәм специаль булмаган продуктлар формалашуны киметәчәк.Иң яхшы нәтиҗәләр өчен, ике праймерның якынча Tm кыйммәтләре булырга тиеш.Әгәр праймер парларның Tm аермасы 5 more-тан артык булса, праймерлар циклда түбән аннальинг температурасын кулланып, зур ялган башлангыч күрсәтәчәк.Ике праймер Тм төрле булса, аннальинг температурасын иң түбән ТМга караганда 5 ℃ түбәнгә куегыз.Альтернатив рәвештә, спецификаны арттыру өчен, биш цикл иң югары ТМ өчен эшләнгән анналь температурада башкарылырга мөмкин, аннары калган цикллар түбән ТМ өчен эшләнгән температурада.Бу максат шаблонының өлешчә күчермәсен кыска шартларда алырга мөмкинлек бирә.

4. Төп чисталык һәм тотрыклылык

Күпчелек PCR кушымталары өчен махсус праймерларның стандарт чисталыгы адекват.Бензойл һәм изобутил группаларын сусызландыру белән чыгару минималь, шуңа күрә PCR белән комачауламый.Кайбер кушымталар синтез процессындагы тулы булмаган эзлеклелекне бетерү өчен чистартуны таләп итәләр.Бу киселгән эзлеклелек ДНК синтезы химиясенең эффективлыгы 100% булмаганга була.Бу түгәрәк процесс, ул химик реакцияләрне кабат куллана, чөнки 3 ′ дан 5 ′ кадәр ДНК ясау өчен һәр база өстәлә.Сез ике циклда да уңышсыз була аласыз.Озын праймерлар, аеруча 50 базадан зуррак булганнар, киселгән эзлеклелектә зур өлешкә ия һәм чистартуны таләп итә ала.

Праймерларның уңышы синтетик химия һәм чистарту ысулының эффективлыгына тәэсир итә.Othитология һәм Шенгонг кебек биофармацевтика компанияләре, олигонуклеозидның гомуми чыгарылышын тәэмин итү өчен, минималь ОД берәмлеген кулланалар.Махсус праймериз коры порошок формасында җибәрелә.Соңгы концентрация 100μМ булсын өчен, TEдагы праймерларны яңадан эретү яхшырак.TE деонизацияләнгән судан яхшырак, чөнки су pH еш кислоталы була һәм олигонуклеозидларның гидролизына китерәчәк.

Праймерларның тотрыклылыгы саклау шартларына бәйле.Коры порошок һәм эретелгән праймериз -20 at сакланырга тиеш.10μM-тан зуррак концентрацияләрдә TEда эретелгән примерлар -20 at 6 ай дәвамында тотрыклы сакланырга мөмкин, ләкин бүлмә температурасында (15 ℃ 30 ℃) 1 атнадан да азрак сакланырга мөмкин.Коры порошок праймериз ким дигәндә 1 ел, бүлмә температурасында (15 С - 30 С) 2 айга кадәр сакланырга мөмкин.

5. Ферментлар һәм аларның концентрацияләре

Хәзерге вакытта кулланылган Так ДНК полимерасы, нигездә, колиформа бактерияләре белән синтезланган ген инженер ферменты.Типик PCR реакциясен катализацияләү өчен кирәк булган фермент күләме якынча 2,5U (100улның гомуми реакция күләмен күрсәтә).Концентрация артык зур булса, ул специаль булмаган көчәйтүгә китерергә мөмкин;концентрациясе бик аз булса, синтетик продукт күләме кимиячәк.

6. DNTP сыйфаты һәм концентрациясе

DNTP сыйфаты концентрация һәм PCR көчәйтү эффективлыгы белән тыгыз бәйләнгән.DNTP порошогы гранулалы, һәм аның үзгәрүчәнлеге дөрес сакланмаган очракта биологик активлыгын югалта.dNTP эремәсе кислоталы, һәм югары концентрациядә кулланылырга тиеш, 1M NaOH яки 1M Tris.HCL буфер эремәсе, аның PH-ны 7.0 ~ 7.5, аз күләмле суб-пакет, туңдырылган саклагыч -20 at.Күп тапкыр туңдыру эретү dNTPны киметәчәк.PCR реакциясендә dNTP 50 ~ 200umol / L булырга тиеш.Бигрәк тә, дүрт DNTPS концентрациясенә игътибар бирелергә тиеш (тигез мең әзерлек).Әгәр аларның берсенең концентрациясе башкалардан аерылып торса (югары яки түбән), туры килмәү килеп чыгачак.Бик аз концентрация PCR продуктларының уңышын киметәчәк.dNTP Mg2 + белән берләшә һәм бушлай Mg2 + концентрациясен киметә ала.

7. Шаблон (максатлы ген) нуклеин кислотасы

Шаблон нуклеин кислотасының күләме һәм чистарту дәрәҗәсе PCR уңышлары яки уңышсызлыгы өчен төп сылтамаларның берсе.Традицион ДНКны чистарту ысуллары, гадәттә, SDS һәм K протеазын кулланалар, үрнәкләрне сеңдерәләр.SDS-ның төп функцияләре: күзәнәк мембранасында липидларны һәм протеиннарны эретү, шулай итеп мембрана протеиннарын эретеп күзәнәк мембранасын юк итү, һәм күзәнәктә атом белгечләрен аеру, SDS шулай ук ​​протеиннар белән берләшә һәм явым-төшем ала;Протеаз К протеиннарны гидролизлый һәм сеңдерә ала, аеруча ДНК белән бәйләнгән гистоннар, аннары органик эретүче фенол һәм хлороформ кулланып, протеиннарны һәм башка күзәнәк компонентларын чыгаралар, һәм нуклеин кислотасын этанол яки изопропил спирты кулланалар.Алынган нуклеин кислотасы PCR реакцияләре өчен шаблон буларак кулланылырга мөмкин.Гомуми клиник ачыклау үрнәкләре өчен тиз һәм гади ысул күзәнәкләрне эретү, патогеннарны лизатлау, хромосомалардан аксымнарны сеңдерү һәм чыгару өчен кулланыла ала, һәм турыдан-туры PCR көчәйтү өчен кулланыла.РНК шаблонын чыгару гадәттә гуанидин изотиокянат яки K протеаз ысулын куллана, RNase РНКны бозмас өчен.

8.Мг2 + концентрация

Mg2 + PCR көчәйтүнең үзенчәлегенә һәм уңышына зур йогынты ясый.Гомумән PCR реакциясендә, төрле dNTP концентрациясе 200умол / Л булганда, Mg2 + ның тиешле концентрациясе 1,5 ~ 2,0 ммол / Л.Mg2 + концентрациясе артык югары, реакция спецификасы кими, специаль булмаган көчәйтү барлыкка килә, бик аз концентрация Так ДНК полимеразының активлыгын киметәчәк, нәтиҗәдә реакция продуктлары кими.

Магний ионнары PCRның берничә аспектына тәэсир итә, мәсәлән, ДНК полимераз активлыгы, уңышка тәэсир итә;Тагын бер мисал - примерны аннальлау, бу үзенчәлеккә тәэсир итә.dNTP һәм шаблон магний ионына бәйләнә, фермент эшчәнлеге өчен кирәк булган бушлай магний ионы күләмен киметә.Оптималь магний ион концентрациясе төрле пример парлары һәм шаблоннар өчен үзгәрә, ләкин 200μM dNTP белән башланган PCR концентрациясе 1,5 мм (искәрмә: реаль вакытта санлы PCR өчен 3-5 мм магний ион эремәсен флуоресцент зонасы белән кулланыгыз).Ирекле магний ионнарының югары концентрацияләре уңышны арттыра, шулай ук ​​билгесез көчәйтүне арттыра һәм тугрылыкны киметә.Оптималь концентрацияне ачыклау өчен, магний ион титрацияләре 1 ммнан 3 ммга кадәр 0,5 мм артуда башкарылды.Магний ионын оптимизациягә бәйләнешне киметү өчен, Платина Так ДНК полимерасы кулланылырга мөмкин.Платина Так ДНК полимерасы Так ДНК полимеразына караганда киң магний ион концентрацияләре өстендә функцияне саклый ала, шуңа күрә оптимизацияне азрак таләп итә.

9. Pcr-пропагандалаучы өстәмәләр

Күпчелек шаблоннарны югары көчәйтү өчен аннальинг температурасын оптимизацияләү, праймериз дизайны, магний ион концентрациясе җитәрлек;шулай да, кайбер шаблоннар, шул исәптән GC эчтәлеге зур булган өстәмә чаралар таләп итә.ДНКның эрү температурасына тәэсир итүче өстәмәләр продуктның үзенчәлеген һәм уңышын яхшырту өчен тагын бер ысул бирә.Иң яхшы нәтиҗәләр өчен шаблонның тулы денатурасы кирәк.

Моннан тыш, икенчел структура пример бәйләүгә һәм ферментларның киңәюенә комачаулый.

PCR өстәмәләре, шул исәптән формамид, DMSO, глицерин, бетаин, һәм PCRx Enhancer Solution көчәйтүне көчәйтәләр.Аларның мөмкин механизмы эретү температурасын киметү, шулай итеп праймерларның аннальләшүенә ярдәм итү һәм икенчел структура өлкәсе аша ДНК полимеразын киңәйтү.PCRx Solution башка өстенлекләргә ия.Платина Так ДНК полимерасы һәм Платина Pfx ДНК полимерасы белән кулланганда минималь магний ионын оптимизацияләү таләп ителә.Шулай итеп, Платина техникасы өстәмә ысул белән берләштерелә, спецификаны арттыру өчен, өченче ысулның бәйләнешен киметү, магний ион оптимизациясе.Иң яхшы нәтиҗәләр өчен өстәмәләр концентрациясе оптимальләштерелергә тиеш, аеруча DMSO, формамид һәм глицерол, алар Так ДНК полимеразын тоткарлый.

 Форази Так ДНК полимерасы

10. Кайнар старт

Кайнар старт PCR - яхшы пример дизайнына өстәп, PCR үзенчәлеген яхшырту өчен иң мөһим ысулларның берсе.Так ДНК полимеразының оптималь озынлыгы 72 булса да, полимераз бүлмә температурасында актив булып кала.Шулай итеп, PCR реакциясен әзерләгәндә һәм җылылык циклы башында тоту температурасы аннальинг температурасыннан түбән булганда җитештерелә.Формалашкач, бу билгесез продуктлар эффектив көчәйтелә.Праймериз дизайны өчен кулланылган сайтлар генетик элементларның урнашуы белән чикләнгәндә, эффектив була, мәсәлән, сайтка юнәлтелгән мутацияләр, экспресс-клонлау, яки ДНК инженериясе өчен кулланылган генетик элементларны төзү һәм манипуляцияләү.

Так ДНК полимеразының эшчәнлеген чикләү өчен гомуми ысул - PCR реакция эремәсен боз өстендә әзерләү һәм аны алдан кызытылган PCR аппаратына урнаштыру.Бу ысул гади һәм арзан, ләкин ул фермент эшчәнлеген тәмамламый, шуңа күрә махсус булмаган продуктларның көчәйтүен тулысынча бетерми.

Rылылык примиясе PCR аппараты денатурация температурасына җиткәнче мөһим компонентны тыеп, ДНК синтезын тоткарлый.Күпчелек кул белән җылылык инициативасы ысуллары, шул исәптән Так ДНК полимеразының тоткарлануы, авыр, аеруча югары үткәрү кушымталары өчен авыр.Башка җылылык белән эшкәртү ысуллары балавыз калканын кулланалар, мөһим компонентны, шул исәптән магний ионнарын яки ферментларны, яки шаблоннар һәм буферлар кебек реактив компонентларны физик яктан изоляцияләү өчен.Rылылык циклы вакытында төрле компонентлар чыгарыла һәм балавыз эреп бергә кушыла.Кул белән кайнар башлау ысулы кебек, балавыз калкан ысулы авыр һәм пычрануга мохтаҗ һәм югары үткәрү кушымталары өчен яраксыз.

Платина ДНК полимерасы автоматик кайнар старт PCR өчен уңайлы һәм эффектив.Платина Так ДНК полимерасы рекомбинант Так ДНК полимеразыннан тора, Так ДНК полимеразына каршы моноклональ антитела белән кушылган.Антитело PCR тарафыннан озак температураны тоту вакытында фермент эшчәнлеген тыю өчен формалаштырылган.Так ДНК полимерасы реакциягә 94 ℃ изоляция вакытында денатурация адымын чыгарды, тулы полимераз активлыгын торгызды.Malылылык башлау өчен химик үзгәртелгән Так ДНК полимеразыннан аермалы буларак, Платина ферменты полимеразны активлаштыру өчен 94 ℃ (10-15 минут) озын изоляция таләп итми.PlatinumTaq DNA полимеразы белән, Так ДНК полимераз эшчәнлегенең 90% 2 минуттан соң 94 at торгызылды.

Foreasy HS Taq DNA полимерасы

11. Оя-PCR

Ояланган праймерлар ярдәмендә көчәйтүнең эзлекле турлары үзенчәлекне һәм сизгерлекне яхшырта ала.Беренче тур - 15 - 20 цикллы стандарт көчәйтү.Башлангыч көчәйтү продуктының кечкенә өлеше 100 - 1000 тапкыр эретелде һәм 15 - 20 цикл өчен көчәйтүнең икенче этабына кушылды.Альтернатив рәвештә, башлангыч көчәйтелгән продукт гел чистарту белән зурланырга мөмкин.Ояланган праймер көчәйтүнең икенче турында кулланыла, ул беренче праймер эчендә максат эзлеклелегенә бәйләнә ала.Ояланган PCR куллану берничә максатлы сайтны көчәйтү мөмкинлеген киметә, чөнки ике праймер комплектын тулыландыручы максатлы эзлеклелек аз.Шул ук примерлар белән бер үк гомуми цикллар (30-40) билгесез сайтларны көчәйттеләр.Ояланган PCR чикләнгән максат эзлеклелегенең сизгерлеген арттыра (мәсәлән, сирәк мрналар) һәм катлаулы PCRS үзенчәлеген яхшырта (мәсәлән, 5 ′ RACE).

12. PCR төшү

PCR төшүе PCRның беренче берничә циклы өчен каты аннальинг шартларын кулланып үзенчәлекне яхшырта.Cycleикл аннальинг температурасында башлана, фаразланган ТМга караганда якынча 5 ℃ югарырак, аннары һәр цикл 1 ℃ 2 to киметелә, анналь температура Tm 5 belowдан түбән булганчы.Иң югары гомология булган максат шаблоны гына көчәйтеләчәк.Бу продуктлар көчәйтелгән билгесез продуктларны туплап, киләсе циклларда киңәюен дәвам итәләр.PCR төшүе пример һәм максат шаблоны арасында гомология дәрәҗәсе билгеле булмаган ысуллар өчен файдалы, мәсәлән, AFLP DNA бармак эзе.

Бәйләнешле PCR комплектлары

 PCR Easyᵀᴹ (Буяу белән)

2 × PCR Герое^TMМикс системасы PCR ингибиторларына гади PCR Микс системасына караганда югарырак толерантлыкка ия, һәм төрле катлаулы шаблоннарның PCR көчәйтүен җиңел генә җиңеп чыга ала.Уникаль реакция системасы һәм югары эффективлык Taq Hero PCR реакциясен көчәйтү эффективлыгын, үзенчәлеген һәм сизгерлеген арттыра.

 PCR Герое (буяу белән)

Higherгары көчәйтү эффективлыгы

Аның 5 '→ 3' ДНК полимераз активлыгы һәм 5 '→ 3' экзонуклаз активлыгы бар, 3 '→ 5' экзонуклаз активлыгы юк.

Реаль Вакыт PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Конкрет - оптимальләштерелгән буфер һәм кайнар старт Так ферменты специаль булмаган көчәйтү һәм пример димер формалашуына комачаулый ала

Sensгары сизгерлек - шаблонның түбән күчермәләрен ачыклый ала

RT-PCR Easyᵀᴹ I (Бер адым)

Комплектта уникаль Foregene кире транскрипция реагенты һәм Foregene HotStar Taq DNA полимерасы уникаль реакция системасы белән кушылып, реакциянең көчәйтү эффективлыгын һәм үзенчәлеген эффектив яхшырту өчен кулланыла.