PCR реагентларының башлангыч этабында праймериз һәм пробларның эшләвен тикшерү һәм иң уңайлы реакция шартларын билгеләү формаль экспериментларның шома алгарышын тәэмин итү өчен алшарт.
Алайса, без беренче этапта праймерны ничек расларга тиеш?
Төп күрсәткечләр - төп, көчәйтү сызыгы, ct бәясе, көчәйтү эффективлыгы, аз концентрацияле үрнәкне ачыклау, CV һ.б.
Төп нигез
PCR көчәйтү сызыгында горизонталь сызык.PCR көчәйтү реакциясенең беренче берничә циклында флуоресцент сигнал күп үзгәрми һәм туры сызык ясый.Бу туры сызык.
PCR праймер зоналарын тикшергәндә, база дәрәҗәсенә игътибар итегез.Праймер зонд концентрациясенең чисталыгы төп базага тәэсир итәчәк, мәсәлән, базның күтәрелүенә яки төшүенә.Төп база шулай ук бик интуитив күрсәткеч.
Көчләндерү сызыгы
Тагын бер интуитив күрсәткеч - көчәйтү сызыгы формасы.Икенчел көчәйтүдән яки башка аномаль көчәйтү кәкреләреннән саклану өчен S формасындагы кәкре булу иң яхшысы.
Ct кыйммәте
Инфляция ноктасына туры килгән цикллар саны базадан экспоненциаль үсешкә кадәр Ct кыйммәте.
Шул ук үрнәк өчен төрле пример зоналары төрле көчәйтү кәкреләренә китерәләр, һәм тиешле Ct кыйммәте көчәйтү эффективлыгы һәм комачаулык дәрәҗәсе тәэсир итәчәк.Теория буенча, без сайлаган праймеризның Ct бәясе кечерәк булса, яхшырак.
Көчләндерү эффективлыгы
PCR көчәйтү эффективлыгын бәяләү өчен иң ышанычлы һәм тотрыклы ысулларның берсе - стандарт сызык, ул шулай ук тикшерүчеләр тарафыннан киң таныла.Метод шаблоннарның чагыштырмача санын контрольдә тоту өчен берничә үрнәк ясарга тиеш.Бу үрнәкләр, гадәттә, концентрацияләнгән запас чишелешләренең серияле эремәләре белән ясала, иң еш кулланыла торганы - 10 тапкыр эретү.Cq кыйммәтен алу өчен көчәйтү өчен стандарт qPCR программасын кулланып, ниһаять, Cq = -klgX0 + b сызыклы тигезләмәне алу өчен, һәм E = 10 (-1 / k) -1 көчәйтү эффективлыгы өчен, стандарт qPCR программасын кулланып.Сан анализы өчен qPCR кулланганда, көчәйтү эффективлыгы 90% -110% диапазонында булырга тиеш (3.6> k> 3.1).
Түбән концентрацияле үрнәкләрне ачыклау
Ampleрнәк концентрациясе түбән булганда, төрле пример зоналарын ачыклау дәрәҗәсе төрле.Күчереп алу өчен без 20 аз концентрацияле үрнәк сайлыйбыз, һәм иң югары ачыклау дәрәҗәсе булган праймериз системасы иң яхшысы.
Variзгәреш коэффициенты (CV)
Нуклеин кислотасын көчәйтүне ачыклау өчен реагентның сызык стандарты буенча 10 дубликат үрнәге төрле пример зоналары белән табылырга мөмкин.
Санлы реагентлар:
Төгәллек
Бер партия эчендә төгәллек туры килергә тиеш: тест концентрациясенең логарифмик кыйммәтенең үзгәрү коэффициенты (CV,%) ≤5%.Ampleрнәк концентрациясе түбән булганда, ачыклау концентрациясенең логарифмының үзгәрү коэффициенты (CV,%) ≤10% тәшкил итә.
Сыйфатлы реагентлар:
Төгәллек
Бер партия эчендәге төгәллек:
(1) Ct кыйммәтенең үзгәрү коэффициенты (CV,%) ≤5%
Шул ук үрнәк параллель рәвештә 10 тапкыр сынала, һәм тест нәтиҗәләре эзлекле булырга тиеш
Пост вакыты: 18-2021 сентябрь
