Вирусның башлангыч этабында, тиз үсеш аркасында, шикләнелгән пациентларга тиз диагноз кую COVID-19 профилактикасы өчен ачкыч булып тора.Кайбер расланган нуклеин кислотасын ачыклау реагентларының кыска үсеш вакыты бар, һәм тиз эшне раслау, реагент оптимизациясе җитмәү, партияләр арасында зур аермалар кебек проблемалар бар;Нуклеин кислотасын ачыклау процессының төрле аспектларында төрле клиник лабораторияләр проблемалары шулай ук ​​нуклеин кислотасын ачыклау нәтиҗәләренең төгәллегенә тәэсир итә ала.Бу мәкалә хәзерге SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклаудагы төп сылтамаларга һәм пунктларга игътибар итәчәк, һәм лаборатория нуклеин кислотасын ачыклау һәм клиник туры килмәү ялган ялган һәм уңай яңадан тикшерү проблемаларын анализлаячак.

SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклау принциплары

SARS-CoV-2 - РНК вирусы, геном эзлеклелеге якынча 29 кб, 10 ген белән, алар 10 протеинны эффектив кодлый ала.Вируслар РНК һәм протеиннардан тора, һәм иң тышкы катлам - липидлардан һәм гликопротеиннардан торган тышкы каплау.Эчтә, протеин капсиды РНКны урый, шуның белән җиңел бозыла торган РНКны саклый (P1).

P1 SARS-COV-2 структурасы

Вируслар инфекция китереп чыгару өчен, күзәнәк өслегенең рецепторлары аша күзәнәкләргә керәләр, һәм күчерү өчен төп күзәнәкләрне кулланалар.

Вируслы нуклеин кислотасын ачыклау принцибы - вируслы РНКны күзәнәк лизаты аша фаш итү, аннары ачыклау өчен реаль вакыттагы флуоресцент кире транскрипция-полимераз чылбыр реакциясен (RT-PCR) куллану.

Ачыклау принцибының ачкычы - нуклеин кислотасы эзлеклелегенең "максатчан туры килүенә" ирешү өчен, ягъни 30,000 базадагы башка вируслардан аерылып торган SARS-CoV-2 нуклеин кислотасы эзлеклелеген табу, примерлар һәм зоналар.

Праймерлар һәм зоналар SARS-CoV-2 нуклеин кислотасының билгеле өлкәсе белән бик туры килә, ягъни спецификасы бик көчле.Сынап каралган үрнәкнең реаль вакыттагы флуоресцент RT-PCR көчәйтү нәтиҗәсе уңай булганнан соң, бу үрнәктә SARS-CoV-2 барлыгын исбатлый.Р2 кара.

P2 SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын билгеләү адымнары (реаль вакыттагы флуоресцент RT-PCR)

SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклау өчен лаборатория шартлары һәм таләпләре

Нуклеин кислотасын сынау лабораторияләре тискәре басым мохите өчен иң идеаль, һәм алар басым мониторингына игътибар итергә, һава агымын сакларга һәм аэрозолларны бетерергә тиеш.Нуклеин кислотасын тикшерүче персонал тиешле квалификациягә ия булырга, полимераз чылбыр реакция реакциясен алырга һәм бәя бирергә тиеш.Лаборатория катгый идарә ителергә, урында зональләштерелергә тиеш, ә бәйләнешсез персоналга керү тыела.Чиста мәйданны җилләтеп, дезинфекцияләргә кирәк.Тиешле әйберләр зоналарга урнаштырыла, чиста һәм пычрак аерыла, вакытында алыштырыла һәм урында пычрана.Гадәттәге дезинфекция: Хлор булган дезинфекция - зур мәйданнар өчен төп чишелеш, һәм 75% спирт кечкенә урыннарда кулланылырга мөмкин.Аэрозоллар белән эш итүнең яхшы ысулы - вентиляция өчен тәрәзәләр ачу, һәм һаваны дезинфекцияләү ультрафиолет нурлары, фильтрлау һәм һаваны дезинфекцияләү ярдәмендә дә башкарылырга мөмкин.

SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын билгеләү төп сылтамалары һәм параметрлары (реаль вакыттагы флуоресцент RT-PCR)

Лабораторияләр, гадәттә, нуклеин кислотасын "ачыклауга" зур игътибар бирсәләр дә, асылда, нуклеин кислотасын "чыгару" шулай ук ​​вирус үрнәкләрен җыю һәм саклау белән тыгыз бәйләнгән уңышлы ачыклау өчен төп адымнарның берсе.

Хәзерге вакытта иң киң кулланылган сулыш үрнәкләре, мәсәлән, насофарингаль караклар, икенче ысулны кулланалар, ул нуклеин кислотасын чыгару һәм лизис эремәсе нигезендә әзерләнгән инактивлаштыру (саклау) эремәсе.Бер яктан, бу вирусны саклау чишелеше вирус протеинын аера ала, активлыгын югалта һәм йогышлы булмый, транспорт һәм ачыклау этабының куркынычсызлыгын яхшырта ала;икенче яктан, ул вирусны нуклеин кислотасын чыгару, нуклеин кислотасын таркатучы ферментны бетерү һәм вирусны булдырмау өчен турыдан-туры ярырга мөмкин.РНК бозылган.

Нуклеин кислотасын чыгару лизис эремәсе нигезендә әзерләнгән вирус сайлау эремәсе.Төп компонентлар - балансланган тозлар, этиленедиаминететрацетик кислотаны эретүче агент, гуанидин тозы (гуанидин изотиокянат, гуанидин гидрохлорид һ.б.), анион сирфактант (додекан) Натрий сульфаты), катион сирфактанты (тетрадецил триметил аммоний оксалат, 8). берничә яки күбрәк компонентлар.Хәзерге вакытта нуклеин кислотасын чыгару комплектлары бик күп, һәм төрле нуклеин кислотасын чыгару һәм чистарту реагентлары кулланыла.Шул ук нуклеин кислотасын чыгару һәм чистарту реагенты кулланылса да, һәр комплектның чыгару процедуралары төрле.

Хәзерге вакытта Милли медицина продуктлары идарәсе тарафыннан расланган нуклеин кислотасын ачыклау комплекты продуктлары SARS-CoV-2 геномындагы ORF1ab, E һәм N геннары нигезендә сайланган.Төрле продуктларны ачыклау принциплары нигездә бер үк, ләкин аларның праймериз һәм тикшерү конструкцияләре төрле.Бер максатлы сегментлар (ORF1ab), ике максатлы сегментлар (ORF1ab, N яки E), һәм өч максатлы сегментлар (ORF1ab, N һәм E) бар.Ачыклау һәм аңлату, нуклеин кислотасын чыгару һәм реаль вакыттагы флуоресцент RT-PCR реакция системасы арасындагы аерма тиешле комплект күрсәтмәләренә мөрәҗәгать итәргә тиеш, һәм кулланучыларга аңлату өчен комплект күрсәтмәләрендә күрсәтелгән аңлату ысулын катгый үтәргә киңәш ителә.Р3-флуоресцент RT-PCR белән көчәйтелгән гомуми регионнар, праймерлар һәм тикшерү эзлеклелеге P3-тә күрсәтелгән.

P3 SARS-CoV-2 ампликон максатының геномдагы урнашуы һәм праймериз һәм пробалар эзлеклелеге.

SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын билгеләү нәтиҗәләрен аңлату (Real-Time флуоресцент RT-PCR)

"Пневмонияне профилактикалау һәм SARS-CoV-2 инфекциясе өчен контроль планы (Икенче басма)" беренче тапкыр бер ген көчәйтү нәтиҗәләрен бәяләү критерийларын ачыклады:

1. Ct яки Ct≥40 тискәре түгел;

2. Ct <37 уңай;

3. 37-40 Ct бәясе - соры масштаблы мәйдан.Экспериментны кабатларга киңәш ителә.Әгәр Ct <40-ны кабатлау һәм көчәйтү сызыгы иң югары дәрәҗәләргә ия булса, үрнәк уңай дип бәяләнә, югыйсә тискәре. "

Белешмәлекнең өченче басмасы һәм дүртенче басма югарыдагы критерийларны дәвам иттеләр.Ләкин, коммерция комплектларында кулланылган төрле максатлар аркасында, югарыда телгә алынган 3 нче басма максатларның кушылуын билгеләү критерийларын бирмәде, җитештерүче биргән күрсәтмәләр өстенлек итә.Белешмәлекнең бишенче басмасыннан башлап, ике максат ачыкланды, аеруча хөкем итү авыр булган бер максат өчен хөкем критерийлары.Ягъни, лаборатория SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклау өчен эшнең уңай булуын расларга теләсә, түбәндәге 2 шартның 1ен үтәргә кирәк:

(1) Бер үк үрнәктә SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) ике мишень реаль вакыттагы флуоресцент RT-PCR тарафыннан уңай сынала.Әгәр бер максат уңай булса, кабат сайлау һәм кабат сынау кирәк.Тест нәтиҗәләре булса, бер максат әле дә уңай булса, ул уңай дип бәяләнә.

.Ләкин, күрсәтмәләр шулай ук ​​ассызыклый, нуклеин кислотасын тикшерүнең тискәре нәтиҗәләре SARS-CoV-2 инфекциясен кире кага алмый.Ялган тискәре йогынты ясарга мөмкин факторлар, шул исәптән начар үрнәк сыйфаты (орофаринкс һәм башка өлешләрдән сулыш алу үрнәкләре), үрнәк җыю бик иртә яки соң, үрнәкләр сакланмаган, ташылмаган һәм эшкәртелмәгән, һәм технологиянең үзендә проблемалар булган (вирус вариациясе, PCR тыюлыгы) һ.б.

SARS-CoV-2 ачыклауда ялган тискәре сәбәпләр

Нуклеин кислотасын сынауда "ялган тискәре" төшенчәсе, еш кына "ялган тискәре" дигәнне аңлата, анда нуклеин кислотасын тикшерү нәтиҗәләре клиник күренешләргә туры килми, ягъни клиник симптомнар һәм сурәтләү нәтиҗәләре COVID-19 шикләнә, ләкин нуклеин кислотасы тестлары һәрвакыт "тискәре".Милли сәламәтлек комиссиясенең клиник лаборатория үзәге "ялган тискәре" SARS-CoV-2 тестын аңлатты.

1) Вируслы кеше күзәнәкләрендә билгеле күләмдә вирус бар.Хәзерге мәгълүматлар шуны күрсәтә: организм вирус белән зарарланганнан соң, вирус тамакка борын һәм авыз аша керә, аннары трахея һәм бронхига керә, аннары альвеолларга барып җитә.Инфекцияләнгән кеше инкубация чорын, йомшак симптомнарны, аннары каты симптомнар процессын һәм авыруның төрле этапларын кичерәчәк.Theәм организмның төрле өлешләрендә булган вирус күләме төрле.

Күзәнәк төрләренең вируслы йөкләнеше ягыннан, альвеолар эпителия күзәнәкләре (аскы сулыш юллары)> һава юллары эпителия күзәнәкләре (өске сулыш юллары)> фибробластлар, эндотелия күзәнәкләре, макрофаглар һ.б.үрнәк тибыннан, альвеолар лава сыеклыгы (иң искиткеч)> тирән йөткерүче балчык> назофарингаль сваб> орофарингаль сваб> кан.Моннан тыш, вирус зәвыкта да табылырга мөмкин.Ләкин, операциянең уңайлылыгын һәм пациентларны кабул итүне исәпкә алып, еш кулланыла торган клиник үрнәк тәртибе - орофарингаль сваб> назофарингаль сваб> бронхиаль лава сыеклыгы (катлаулы операция) һәм тирән балчык (гадәттә коры йөткерү, алу авыр).

Шуңа күрә, кайбер пациентларның орофаринкс яки назофаринкс күзәнәкләрендә вирус күләме аз яки бик аз.Тикшерү өчен орофаринкс яки назофаринкс үрнәкләре генә алынса, вируслы нуклеин кислотасы табылмаячак.

2) ampleрнәк җыю вакытында вирус булган күзәнәкләр җыелмады, яки вируслы нуклеин кислотасы эффектив сакланмады.

[Collection Дөрес булмаган җыю мәйданы, мәсәлән, орофарингаль каракларны җыйганда, җыю тирәнлеге җитми, җыелган назофарингаль караклар борын куышлыгына тирән җыелмый һ.б. collectedыелган күзәнәкләрнең күбесе вируссыз күзәнәкләр булырга мөмкин;

Ampл үрнәкләрен дөрес кулланмыйлар.Мисал өчен, синтетик җепселләр, PE җепселләре, полиэстер җепселләр һәм полипропилен җепселләр баш башы материалы өчен тәкъдим ителә.Пахта кебек табигый җепселләр фактик эштә кулланыла (протеинның көчле adsorbsion һәм юу җиңел түгел) һәм нейлон җепселләре (су начар үзләштерү, сайлау күләменең җитмәвенә китерә);

Вирус саклау трубаларын дөрес кулланмау, мәсәлән, полипропилен яки полиэтилен пластик саклагыч трубаларны дөрес кулланмау, нуклеин кислоталарын (ДНК / РНК) үзләштерү җиңел, нәтиҗәдә саклагыч эремәсендә нуклеин кислотасы концентрациясе кими.Практикада вируслы нуклеин кислоталарын саклау өчен полиэтилен-пропилен полимер пластмассаны һәм махсус эшкәртелгән полипропилен пластик савытларны кулланырга киңәш ителә.]

[Collection Дөрес булмаган җыю мәйданы, мәсәлән, орофарингаль каракларны җыйганда, җыю тирәнлеге җитми, җыелган назофарингаль караклар борын куышлыгына тирән җыелмый һ.б. collectedыелган күзәнәкләрнең күбесе вируссыз күзәнәкләр булырга мөмкин;

Ampл үрнәкләрен дөрес кулланмыйлар.Мисал өчен, синтетик җепселләр, PE җепселләре, полиэстер җепселләр һәм полипропилен җепселләр баш башы материалы өчен тәкъдим ителә.Пахта кебек табигый җепселләр фактик эштә кулланыла (протеинның көчле adsorbsion һәм юу җиңел түгел) һәм нейлон җепселләре (су начар үзләштерү, сайлау күләменең җитмәвенә китерә);

Вирус саклау трубаларын дөрес кулланмау, мәсәлән, полипропилен яки полиэтилен пластик саклагыч трубаларны дөрес кулланмау, нуклеин кислоталарын (ДНК / РНК) үзләштерү җиңел, нәтиҗәдә саклагыч эремәсендә нуклеин кислотасы концентрациясе кими.Практикада вируслы нуклеин кислоталарын саклау өчен полиэтилен-пропилен полимер пластмассаны һәм махсус эшкәртелгән полипропилен пластик савытларны кулланырга киңәш ителә.]

(4) Клиник лаборатория эше стандартлаштырылмаган.Транспорт һәм саклау шартлары үрнәге, клиник лабораторияләрнең стандарт эшләве, нәтиҗәләрне аңлату һәм сыйфат контроле - тест нәтиҗәләренең төгәллеген һәм ышанычлылыгын тәэмин итү өчен төп факторлар.Милли Сәламәтлек Комиссиясенең Клиник Лаборатория Centerзәге тарафыннан 2020 елның 16-24 мартында үткәрелгән тышкы сыйфат бәяләү нәтиҗәләре буенча, дөрес нәтиҗәләр алган 844 лабораториянең 701 (83,1%) квалификацияле, 143 (16,9%) булмаган.Квалификацияле, гомуми лаборатория сынау шартлары яхшы, ләкин төрле лабораторияләрдә персоналның эш сәләте, бер максатлы уңай үрнәк аңлату сәләте, сыйфат контроле буенча аермалар бар.

SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклауның ялган тискәресен ничек киметергә?

Нуклеин кислотасын ачыклауда ялган негативларны киметү ялган тискәре җитештерүнең дүрт ягыннан оптимальләштерелергә тиеш.

1) Вируслы кеше күзәнәкләрендә билгеле күләмдә вирус бар.Вирусның зарарланган кешеләр организмының төрле өлешләрендә концентрациясе төрле вакытта төрле булачак.Әгәр дә фаринкс булмаса, ул бронхиаль лавада сыеклыкта яки зәвыкта булырга мөмкин.Әгәр дә берничә төр үрнәк бер үк вакытта яки сынау өчен авырулар үсешенең төрле этапларында җыела алса, ялган тискәре күренешләрдән сакланырга ярдәм итәчәк.

2) Вирус булган күзәнәкләр үрнәк җыю вакытында җыелырга тиеш.Бу проблеманы үрнәк җыючыларның әзерлеген көчәйтеп чишеп була.

(3) Ышанычлы IVD реагентлары.Милли дәрәҗәдә реагентларны ачыклауны бәяләү буенча тикшеренүләр үткәреп, булган проблемалар турында сөйләшеп, реагентларны табу эффективлыгы тагын да яхшырырга һәм анализның сизгерлеге яхшырырга мөмкин.

(4) Клиник лабораторияләрнең стандарт эше.Лаборатория персоналын әзерләүне көчәйтеп, лаборатория сыйфатын идарә итү системасын өзлексез камилләштереп, бүленешләрне тәэмин итеп, персоналның ачыклау сәләтен яхшыртып, лабораториянең дөрес булмаган операцияләре аркасында ялган тискәре якларны киметергә мөмкин.

Сакланган һәм чыгарылган пациентларда SARS-CoV-2 нуклеин кислотасы сынавының уңай тестын кабатлау сәбәпләре

"COVID-19 диагностикалау һәм дәвалау планы (җиденче сынау)" COVID-19 пациентларының дәвалану һәм больницадан чыгарылу критерийларының берсе - ике рәт сулыш юлының тискәре нуклеин кислотасы сынавы (ким дигәндә 24 сәгать аралыгында), ләкин бик аз, SARS-CoV-2 нуклеин кислотасы тестында уңай булган.

(1) SARS-CoV-2 - яңа вирус.Аның патогеник механизмын, китерелгән авыруның тулы сурәтен һәм авыру курсының үзенчәлекләрен тагын да аңларга кирәк.Шуңа күрә, бер яктан, чыгарылган пациентлар белән идарә итүне көчәйтергә һәм 14 көнлек медицина күзәтүе үткәрергә кирәк.Авыруның барлыкка килүен, үсешен һәм нәтиҗәләрен аңлауны тирәнәйтү өчен, күзәтү, сәламәтлекне күзәтү һәм сәламәтлек белән идарә итү.

2) Пациент кабат вирус белән зарарланырга мөмкин.Академик Чжун Наншан әйтте: Дәваланган пациентларның антителалары булганга, SARS-CoV-2 кабат һөҗүм иткәндә антителалар белән юкка чыгарылырга мөмкин.Бик күп сәбәпләр бар, алар торгызылган пациентның сәбәбе булырга мөмкин, яки бу вирус мутациясе, хәтта лаборатория тикшерүе белән дә бәйле булырга мөмкин.Әгәр дә ул вирус булса, SARS-CoV-2 мутациясе торгызылган пациент җитештергән антителаның мутацияләнгән вируска каршы эффектив булмавына китерергә мөмкин.Әгәр пациент кабат мутацияләнгән вирус белән зарарланса, нуклеин кислотасы тесты кабат уңай булырга мөмкин.

3) Лаборатория сынау ысулларына килгәндә, һәр сынау ысулының чикләре бар.SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын ачыклау ген эзлеклелеген сайлау, реагентлар составы, ысулның сизгерлеге һәм башка сәбәпләр аркасында, булган комплектларның түбән ачыклау чикләренә ия.Пациент дәваланганнан соң, организмдагы вирус кими.Тикшерелергә тиешле үрнәктәге вируслы йөкләү ачыклауның түбән чигеннән түбән булганда, "тискәре" нәтиҗә барлыкка киләчәк.Ләкин бу нәтиҗә организмдагы вирусның бөтенләй юкка чыгуын аңлатмый.Вирус дәвалау туктатылганнан соң булырга мөмкин.Яңарыш ”, күчерүне дәвам итегез.Шуңа күрә, чыгарылганнан соң 2 - 4 атна эчендә атнага бер тапкыр карарга киңәш ителә.

(4) Нуклеин кислотасы - вирусның генетик материалы.Вирус пациент вируска каршы дәваланганнан соң үтерелә, ләкин калган вируслы РНК фрагментлары әле дә кеше организмында саклана, һәм организмнан тулысынча чыгарылмый.Кайвакыт, билгеле бер шартларда, аны күбрәк саклап була.Озак вакыт, һәм бу вакытта нуклеин кислотасы тесты "вакытлыча" уңай булачак.Пациентның торгызу вакыты озайтылгач, организмдагы калдыклы РНК фрагментлары әкренләп беткәч, нуклеин кислотасын тикшерү нәтиҗәләре тискәре булырга мөмкин.

(5) SARS-CoV-2 нуклеин кислотасын тикшерү нәтиҗәсе вируслы РНКның булуын яки юклыгын раслый, һәм вирусның активлыгын һәм вирусның таралу мөмкинлеген раслый алмый.Уңай нуклеин кислотасы сынавы булган пациентның кабат инфекция чыганагына әйләнүен исбатларга кирәк.Вирус культурасын клиник үрнәкләрдә алып барырга һәм аның йогышлы булуын исбатлау өчен "тере" вирус үстерергә кирәк.

Аннотация

Йомгаклап әйткәндә, SARS-CoV-2 нуклеин кислотасы ялган тискәре, рестест позитив һәм клиник күренешләргә туры килмәгән башка шартларны сынап булмый.Факттагы скринкада һәм тестта клиник симптомнарны, имидж тикшерүләрен (КТ) һәм экспериментларны берләштерергә киңәш ителә Лаборатория тесты (нуклеин кислотасы тесты + вирус специфик антитела тесты) сагынылган диагностиканы һәм ялгыш диагнозны булдырмау өчен комплекслы диагностикалау нәтиҗәләрен.Әгәр дә тест нәтиҗәләре клиник күренешләргә туры килми икән, SARS-CoV-2 вирусын иртә инфекцияләү, кабатланучы инфекция яки башка сулыш вирусы инфекциясе белән кушылу өчен, бөтен сынау сылтамасына (үрнәк җыю, әйләнеш һәм эшкәртү сылтамалары) комплекслы анализ ясарга киңәш ителә.Әгәр шартлар рөхсәт ителсә, кабат тикшерү өчен балчык яки альвеолар лав сыеклыгы кебек сизгер үрнәкләр җыярга киңәш ителә.

Бәйләнешле продуктлар ：

SARS-CoV-2 Нуклеин кислотасын ачыклау комплекты (мультиплекс PCR флуоресцент тикшерү ысулы)