• PCR - аз күләмле ДНК шаблоныннан ДНКны көчәйтү ысулы.RT-PCR кире транскрипция куллана, РНК чыганагыннан ДНК шаблонын чыгару өчен, аннары көчәйтелә ала.
• PCR һәм RT-PCR гадәттә ахыргы реакцияләр, ә qPCR һәм RT-qPCR булган шаблон күләмен санау өчен PCR реакциясе вакытында продукт синтезы тизлегенең кинетикасын кулланалар.
• Санлы PCR кебек яңа ысуллар башлангыч ДНК шаблонының абсолют санын тәэмин итә, изотермаль PCR кебек ысуллар ышанычлы нәтиҗәләр бирү өчен кыйммәтле җиһазларга ихтыяҗны киметә.

Полимераз чылбыр реакциясе (PCR) - ДНК һәм РНК эзлеклелеген көчәйтү һәм ачыклау өчен чагыштырмача гади һәм киң кулланылган молекуляр биология техникасы.ДНК клонлаштыру һәм көчәйтү традицион ысуллары белән чагыштырганда, еш кына берничә көн кирәк була, PCR берничә сәгать кенә таләп итә.PCR бик сизгер һәм конкрет эзлеклелекне ачыклау һәм көчәйтү өчен минималь шаблон таләп итә.PCR төп ысуллары гади ДНК һәм РНКны ачыклаудан алга киттеләр.Түбәндә, без сезнең PCR ихтыяҗларыгыз өчен төрле PCR ысуллары һәм Enzo Life Science'та күрсәткән реагентлар турында күзаллау бирдек.Без галимнәргә PCR реагентларына тиз арада киләсе тикшеренү проектында кулланырга булышырга уйлыйбыз!

PCR

Стандарт PCR өчен сезгә ДНК полимерасы, магний, нуклеотидлар, праймерлар, көчәйтелергә тиешле ДНК шаблоны һәм термоциклер кирәк.PCR механизмы аның максаты кебек гади: 1) ике катлы ДНК (dsDNA) җылылык денатурасы, 2) праймериз бер ДНК полосасына тигезләнә, 3) праймериз ДНК полимерасы белән киңәйтелә, нәтиҗәдә ике күчермә оригиналь ДНК полосасы.Денатурация, аннальинг һәм озынлык процессы температура һәм вакыт аралыгында көчәйтүнең бер циклы буларак билгеле (1 нче рәсем).

Cycleиклның һәр адымы кулланылган шаблон һәм праймер комплекты өчен оптимальләштерелергә тиеш.Бу цикл якынча 20-40 тапкыр кабатлана, һәм көчәйтелгән продуктны анализларга була, гадәттә агароза гели (2 нче рәсем).

PCR бик сизгер ысул булганлыктан һәм бер реакция өчен бик кечкенә күләмнәр кирәк булганлыктан, берничә реакциягә мастер-катнашма әзерләү тәкъдим ителә.Мастер катнашма яхшы кушылырга, аннары реакцияләр саны буенча бүленергә тиеш, һәр реакциядә бер үк күләмдә фермент, dNTP һәм праймерлар булуын тәэмин итү.Enzo Life Science кебек күп тәэмин итүчеләр шулай ук ​​PCR катнашмаларын тәкъдим итәләр, аларда праймериз һәм ДНК шаблоныннан кала барысы да бар.

Гуан / tитосинга бай (GC бай) төбәкләр стандарт PCR техникасында кыенлык күрсәтәләр.GC бай эзлеклелеге түбән GC эчтәлеге булган эзлеклелеккә караганда тотрыклырак.Моннан тыш, GC-га бай эзлеклелектә чәч структуралары кебек икенчел структуралар барлыкка килә.Нәтиҗәдә, GC бай ике юлны денатурация этабында тулысынча аеру кыен.Димәк, ДНК полимерасы яңа чыбыкны комачауламыйча синтезлый алмый.Higherгары денатурация температурасы моны яхшырта ала, һәм югарырак анналь температурага һәм кыскарту вакытына үзгәрешләр GC бай праймерларның билгеле бәйләнешен булдырмаска мөмкин.Өстәмә реагентлар GC бай эзлеклелеген көчәйтергә мөмкин.DMSO, глицерол һәм бетаин GC үзара бәйләнеш аркасында килеп чыккан икенчел структураларны бозырга ярдәм итә һәм шуның белән ике юлны аерырга ярдәм итә.

PCR кайнар старт

Билгесез көчәйтү - PCR вакытында булырга мөмкин проблема.PCR өчен кулланылган күпчелек ДНК полимеразлары 68 ° C - 72 ° C тирәсендә иң яхшы эшли.Фермент, түбән дәрәҗәдә булса да, түбән температурада актив булырга мөмкин.Аннальинг температурасыннан күпкә түбән температурада, праймерлар махсус булмаганны бәйлиләр һәм реакция боз өстендә куелса да, специаль булмаган көчәйтүгә китерергә мөмкин.Бу полимераз ингибиторларын кулланып, билгеле бер температура җиткәч, ДНК полимеразыннан аерыла, димәк, PCR кайнар термины.Ингибитор полимеразны һәм денатураны башлангыч денатурация температурасында бәйләүче антитела булырга мөмкин (гадәттә 95 ° C).

Fгары тугрылыклы полимераз

ДНК полимеразлары шаблон эзлеклелегенә төгәл төгәлләнсә дә, нуклеотидка туры килүдә хаталар булырга мөмкин.Клонлаштыру кебек кушымталардагы туры килмәүләр киселгән транскрипцияләргә китерергә мөмкин, һәм түбән агымда бүленмәгән яки актив булмаган аксымнар.Бу туры килмәүдән саклану өчен, "тикшерү" эшчәнлеге булган полимеразалар ачыкланды һәм эш процессына кертелде.Беренче тикшерү полимерасы, Pfu, 1991-нче елда Пирококк фуриосында ачыкланган.Бу Pfu ферментының 3 '5' экзонуклаз активлыгы бар.ДНК көчәйтелгәндә, экзонуклаз туры килмәгән нуклеотидларны чыбыкның 3 'очында бетерә.Аннары дөрес нуклеотид алыштырыла, һәм ДНК синтезы дәвам итә.Дөрес булмаган нуклеотид эзлеклелеген ачыклау фермент белән дөрес нуклеозид трифосфаты өчен бәйләнешкә нигезләнә, монда эффектив бәйләү синтезны акрынайта һәм дөрес алыштырырга мөмкинлек бирә.Pfu полимеразының тикшерү эшчәнлеге соңгы эзлеклелектә Так ДНК полимеразы белән чагыштырганда азрак хаталар китерә.Соңгы елларда башка тикшерү ферментлары ачыкланды, һәм Pfu ферментының оригиналь үзгәртүләре ДНК көчәйтү вакытында хата ставкасын тагын да киметү өчен ясалды.

RT-PCR

Кире транскрипция PCR, яки RT-PCR, РНКны шаблон итеп кулланырга мөмкинлек бирә.Өстәмә адым РНКны табарга һәм көчәйтергә мөмкинлек бирә.РНК кире транскриптаз кулланып, тулыландырылган ДНКга (CDNA) кире транскрипцияләнә.РНА шаблонының сыйфаты һәм чисталыгы RT-PCR уңышлары өчен бик кирәк.RT-PCRның беренче адымы - ДНК / РНК гибрид синтезы.Кире транскриптазның шулай ук ​​гибридның РНК өлешен киметүче RNase H функциясе бар.Бер полосалы ДНК молекуласы аннары ДНКга бәйле ДНК полимераз активлыгы белән CDNAга кире транскриптазның активлыгы белән тәмамлана.Беренче катлы реакциянең эффективлыгы көчәйтү процессына тәэсир итә ала.Моннан, стандарт PCR процедурасы cDNA көчәйтү өчен кулланыла.ТР-PCR тарафыннан РНКны CDNAга кире кайтару мөмкинлеге күп өстенлекләргә ия, һәм ул беренче чиратта ген экспрессиясен анализлау өчен кулланыла.РНК бер катлы һәм бик тотрыксыз, бу аны эшләүне кыенлаштыра.Бу гадәттә qPCR-ның беренче адымы булып хезмәт итә, ул биологик үрнәктә РНК транскрипцияләрен саный.

qPCR һәм RT-qPCR

Санлы PCR (qPCR) күп кушымталар өчен нуклеин кислоталарын табу, характерлау һәм бәяләү өчен кулланыла.RT-qPCRда, РНК транскрипцияләре еш кына югарыда әйтелгәнчә, башта CDNAга кире транскрипция белән бәяләнә, аннары qPCR соңрак үткәрелә.Стандарт PCRдагы кебек, ДНК өч кабатлау адымы белән көчәйтелә: денатурация, аннальинг һәм озынлык.Ләкин, qPCRда, флюоресцент маркировкалар PCR алга барган саен мәгълүмат тупларга мөмкинлек бирә.Бу ысулның методлар һәм химия төрләре аркасында күп файдасы бар.

Буяуга нигезләнгән qPCR (гадәттә яшел), флуоресцент маркировкалау dsDNA бәйләүче буяу кулланып көчәйтелгән ДНК молекулаларын санлаштырырга мөмкинлек бирә.Eachәр цикл вакытында флюоресенция үлчәнә.Флуоресцент сигнал кабатланган ДНК күләменә пропорциональ арта.Димәк, ДНК “реаль вакытта” күләмләнә (3 нче рәсем).Буяуга нигезләнгән qPCRның кимчелекләре - берьюлы бер максатны тикшереп була һәм буяу үрнәктә булган теләсә нинди ds-DNA белән бәйләнәчәк.

Тикшеренү нигезендә qPCRда, күп үрнәкләр бер үк вакытта һәр үрнәктә табылырга мөмкин, ләкин моның өчен оптимизация һәм праймерларга өстәп кулланылган максатчан махсус зоналар дизайны таләп ителә.Зонд конструкцияләренең берничә төре бар, ләкин иң еш очрый торган төр - гидролиз зонасы, ул фторофор һәм сүндергечне үз эченә ала.Флуоресцент резонанс энергия тапшыру (ФРЕТ) флорофорның сүндергеч аша чыгарылуына комачаулый.Ләкин, PCR реакциясе вакытында, праймер примерны киңәйтү һәм бәйләнгән махсус эзлеклелекне көчәйтү вакытында гидролизацияләнә.Пробның ярылуы фторофорны сүндергечтән аера һәм флуоресенциянең көчәйтүгә бәйле артуына китерә (4 нче рәсем).Шулай итеп, пробка нигезләнгән qPCR реакциясеннән флуоресцент сигнал үрнәктә булган тикшерү максаты эзлеклелеге күләменә пропорциональ.Тикшеренү нигезендәге qPCR буяуга нигезләнгән qPCRга караганда конкретрак булганга, ул еш кына qPCR нигезендә диагностик анализларда кулланыла торган технология.

Изотермаль көчәйтү

Aboveгарыда телгә алынган PCR кыйммәтле термоцикл җиһазларын денатурация, аннальлау һәм киңәйтү адымнары өчен камера температурасын төгәл күтәрү өчен таләп итә.Мондый төгәл җайланмаларга мохтаҗ булмаган һәм гади су мунчасында яки хәтта кызыклы күзәнәкләр эчендә башкарылырга мөмкин булган берничә техника эшләнде.Бу ысуллар бергәләп изотермаль көчәйтү дип атала һәм экспоненциаль, сызыклы яки каскад көчәйтү нигезендә эш.

Изотермаль көчәйтүнең иң танылган төре - әйләнешле изотермаль көчәйтү, яки LAMP.Лампа ДНК яки РНК шаблонын көчәйтү өчен 65⁰C температурада экспоненциаль көчәйтү куллана.Лампаны эшләгәндә, максатчан ДНК өлкәләрен тулыландыручы дүрт-алты праймер яңа ДНК синтезлау өчен ДНК полимерасы белән кулланыла.Бу праймерларның икесенең мактаулы эзлеклелеге бар, алар башка праймерлардагы эзлеклелекне таныйлар һәм бәйлиләр, яңа синтезланган ДНКда "цикл" структурасын формалаштырырга мөмкинлек бирәләр, аннары көчәйтүнең алдагы турларында примерны аннальләштерергә булышалар.Лампаны флюоресенция, агароза гели электрофорезы яки колориметрия кебек берничә ысул белән визуальләштереп була.Колориметрия буенча продуктның булуын яки булмавын визуальләштерү һәм ачыклау җиңеллеге һәм кирәкле кыйммәтле җиһазлар булмау LAMP-ны клиник лаборатория сынаулары җиңел булмаган өлкәләрдә SARS-CoV-2 сынау өчен яраклы вариантка әйләндерде, яки үрнәкләрне саклау һәм ташу. мөмкин булмаган, яисә элек PCR термоцикл җайланмалары булмаган лабораторияләрдә.