Башлангыч материал: РНК
Санлы кире транскрипция PCR (RT-qPCR) - PCR экспериментларында башлангыч материал буларак РНК кулланып кулланылган эксперименталь ысул.Бу ысулда гомуми РНК яки хәбәрче РНК (mRNA) кире транскриптаз ярдәмендә тулыландырылган ДНКга (CDNA) күчерелә.Соңыннан, шаблон буларак cDNA ярдәмендә qPCR реакциясе башкарылды.RT-qPCR төрле молекуляр биология кушымталарында кулланылган, шул исәптән ген экспрессиясен анализлау, РНК интерфейсын тикшерү, микроаррей тикшерү, патоген ачыклау, генетик тикшерү, һәм авыруларны тикшерү.
RT-qPCR өчен бер адымлы һәм ике адымлы ысуллар
RT-qPCR бер адым яки ике адымлы ысул белән башкарылырга мөмкин.Бер адымлы RT-qPCR кире транскрипцияне һәм PCR көчәйтүне берләштерә, кире транскриптаз һәм ДНК полимеразын бер үк трубада реакцияне шул ук буфер шартларында тәмамларга мөмкинлек бирә.Бер адымлы RT-qPCR эзлеклелектә махсус праймериз куллануны таләп итә.Ике адымлы RT-qPCRда, кире транскрипция һәм PCR көчәйтү ике трубада башкарыла, төрле оптимизацияләнгән буферлар, реакция шартлары һәм праймериз дизайн стратегиясе.
Өстенлек | Кимчелек | |
Бер адым | Бу ысулның эксперименталь хата азрак, чөнки ике реакция дә бер трубада эшләнгән
Азрак үткәргеч адымнар пычрану куркынычын киметә
Highгары үткәргеч көчәйтү / скринка, тиз һәм кабат чыгару өчен яраклы | Ике адымлы реакцияләрне аерым оптимальләштереп булмый
Ике адымлы реакцияне берләштереп реакция шартлары бозылганлыктан, сизгерлек ике адымлы ысул кебек яхшы түгел.
Бер үрнәк белән ачыкланган максатлар саны аз |
Ике адым | Озак вакыт саклана һәм күп реакцияләрдә кулланыла торган тотрыклы cDNA китапханәләрен булдыру сәләте
Максатлы геннар һәм белешмә геннар бер үк cDNA китапханәсеннән берничә cDNA китапханәсенә мохтаҗлыксыз көчәйтелергә мөмкин
Реакция буферлары һәм бер реакцияне оптимальләштерергә мөмкинлек бирүче реакция шартлары
Тригер шартларының сыгылмалы сайлануы | Берничә труба куллану, һәм күбрәк адым ясау ДНК пычрану куркынычын арттыра, һәм вакыт таләп итә.
Бер адымлы ысулдан күбрәк оптимизация таләп итә |
Бәйләнешле продуктлар:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бер адым) -SYBR Яшел I.
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бер адым) -Такман
RT Easyᵀᴹ I Беренче катлы CDNA синтезы өчен I Master Premix
Реаль Вакыт PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Гомуми РНК һәм mRNA сайлау
RT-qPCR экспериментын эшләгәндә, гомуми РНКны яки чистартылган mRNA-ны кире транскрипция өчен шаблон итеп кулланыргамы-юкмы дигән карар кабул итү мөһим.MRNA бераз югарырак сизгерлек бирә алса да, гомуми РНК еш кулланыла.Моның сәбәбе - гомуми РНКның mRNAга караганда башлангыч материал буларак мөһим өстенлеге бар.Беренчедән, процесс азрак чистарту адымнарын таләп итә, бу шаблонның сан ягыннан яхшырак торгызылуын һәм күзәнәк саннарын башлау нәтиҗәләрен яхшырак нормалаштыруны тәэмин итә.Икенчедән, ул mRNA-ны баету адымыннан кача, бу төрле mRNA-ның төрле торгызылуы аркасында шиксез нәтиҗәләр булу мөмкинлегеннән кача ала.Гомумән алганда, күпчелек кушымталарда максатлы генның чагыштырмача күләме ачыклауның абсолют сизгерлегенә караганда мөһимрәк, гомуми РНК күпчелек очракта кулайрак.
Кире транскрипция праймеры
Ике этаплы ысулда, cDNA реакциясен төпләү өчен өч төрле ысул кулланырга мөмкин: олиго (dT) праймериз, очраклы праймерлар, яки эзлекле примерлар.Гадәттә, олиго (dT) праймерлары һәм очраклы праймерлар бергә кулланыла.Бу праймериз mRNA шаблонына ябыштырыла һәм синтез өчен башлангыч нокта белән кире транскриптаз тәэмин итә.
Праймер сайлау | Структурасы һәм функциясе | Өстенлек | Кимчелек |
Олиго (dT) праймер (яки якорь олиго (dT) праймер) | МРНА поли (А) койрыгында тимин калдыкларына киңәйтелгән;анкор олиго (dT) праймерында 3 ′ очында G, C, яки A бар (якорь сайты) | Поли (А) койрыклы mRNAдан тулы озынлыктагы CDNA синтезы
Аз башлангыч материал булганда кулланыла
Анкоринг сайты олиго (dT) праймерның 5 ′ поли (A) койрыгына бәйләнешен тәэмин итә. | Поли (А) койрыклары белән геннарны көчәйтү өчен генә яраклы
Поли (A) сайтында * 2 киселгән cDNA алыгыз.
3 ′ ахырына бәйләнергә битараф *
* Анкорлы олиго (dT) праймерлары кулланылса, бу мөмкинлек минимальләштерелә |
очраклы праймер
| Озынлыгы 6 - 9 нигез, алар РНК транскрипциясе вакытында берничә сайтка кушылырга мөмкин | Барлык РНКларга анналь (tRNA, rRNA, mRNA)
Мөһим икенчел структурасы булган транскрипцияләр өчен, яисә аз башлангыч материал булганда
CDгары cDNA уңыш | cDNA барлык РНКдан кире транскрипцияләнгән, гадәттә теләмәгән һәм максатлы mRNA сигналын эретергә мөмкин
киселгән cDNA алу |
эзлеклелектәге праймериз | Аерым mRNA эзлеклелегенә юнәлтелгән махсус праймериз | махсус cDNA китапханәсе
Сәнгатьчәнлекне яхшырту
Кире qPCR праймерларын куллану | Бер максатлы ген синтезы белән генә чикләнәләр |
Кире транскрипт
Кире транскриптаз - РНКны ДНК синтезлау өчен кулланган фермент.Кайбер кире транскрипталар RNase эшчәнлегенә ия һәм транскрипциядән соң РНК-ДНК гибрид полосаларында РНК полосаларын киметергә мөмкин.Әгәр дә аның RNase энзиматик активлыгы булмаса, югары qPCR эффективлыгы өчен RNaseH өстәргә мөмкин.Гадәттә кулланыла торган ферментларга Молоней мурин лейкозы вирусы кире транскриптаз һәм кош миелобластомасы вирусы кире транскриптаз керә.RT-qPCR өчен, югары термостиллылыгы булган кире транскриптазны сайлау идеаль, шуңа күрә cDNA синтезы югары температурада башкарылырга мөмкин, югары дәрәҗәдәге структуралы РНКларның уңышлы транскрипциясен тәэмин итү, шул ук вакытта реакция дәвамында тулы активлыгын саклап калу, югары CDNA җитештерүчәнлеге.
Бәйләнешле продуктлар:
Кире транскриптазның RNase H эшчәнлеге
RNaseH РНК полосаларын РНК-ДНК дуплексларыннан киметә ала, ике катлы ДНКны эффектив синтезларга мөмкинлек бирә.Ләкин, озын mRNA шаблон буларак кулланганда, РНК вакытыннан алда бозылырга мөмкин, нәтиҗәдә CDNA киселгән.Шуңа күрә, озын транскрипцияләр синтезы кирәк булса, cDNA клонлау вакытында RNaseH эшчәнлеген киметү еш файдалы.Киресенчә, RNase H эшчәнлеге белән кире транскрипталар qPCR кушымталары өчен еш файдалы, чөнки алар PCRның беренче циклында RNA-DNA дуплексларының эрүен көчәйтәләр.
Праймер дизайны
RT-qPCRдагы qPCR адымы өчен кулланылган PCR праймериз идеаль рәвештә экзон-экзон чишелешен киңәйтү өчен эшләнергә тиеш, монда көчәйтү праймеры экзон-интрон чикләрен киңәйтә ала.Геномик ДНК эзлеклелеге көчәйтелмәгәнлектән, бу конструкция геном ДНКны пычратудан көчәйтелгән ялган позитивлар куркынычын киметә.
Әгәр праймериз экзоннарны яки экзон-экзон чикләрен аеру өчен ясалмаса, геномик ДНК пычрануын бетерү өчен, RNA үрнәкләрен RNase-DNase I яки dsDNase белән эшкәртергә кирәк булырга мөмкин.
RT-qPCR контроле
Кире транскрипция тискәре контроль (-RT контроле) барлык RT-qPCR экспериментларына ДНК пычрануын ачыклау өчен кертелергә тиеш (мәсәлән, геном ДНК яки PCR реакцияләре элеккеге реакцияләрдән).Бу контроль кире транскриптаздан кала барлык реакция компонентларын үз эченә ала.Кире транскрипция бу контроль белән булмаганга, PCR көчәйтү күзәтелсә, ДНКдан пычрану ихтималы зур.
Пост вакыты: Август-02-2022