• facebook
  • бәйләнгән
  • youtube

1. РНК эремәсенең үзләштерүен ачыклагыз

280, 320, 230, һәм 260 нмдагы абсорбция нуклеин кислотасы, фон (эремә турбитлыгы), тоз концентрациясе һәм протеин кебек органик матдәләр кыйммәтләрен күрсәтә.Гадәттә OD260 / OD280 гына карагыз (Нисбәт, Р).1.8 ~ 2.0 булганда, без РНКдагы протеин яки башка органик матдәләрнең пычрануына юл куярга мөмкин дип уйлыйбыз, ләкин шуны әйтергә кирәк: Трис үзләштерүне ачыклау өчен буфер буларак кулланылганда, R бәясе 2тән зуррак булырга мөмкин (гадәттә ул <2.2 булырга тиеш).R <1.8 булганда, эремәдәге протеин яки башка органик матдәләрнең пычрануы ачыклана, һәм РНК язмышы ихтыяҗларга карап билгеле була.R> 2.2 булганда, РНК бер нуклеин кислотасына гидролизацияләнгән дигән сүз.
 
2. РНКның электрофоретик үрнәге
Гадәттә, денатурлау гели РНК электрофорезы өчен кулланыла, ләкин ул РНК сыйфатын ачыклау өчен генә кулланылса, денатурлау гели кирәк түгел, һәм гади агароза гели кулланылырга мөмкин.Электрофорезның максаты - 28S һәм 18S полосаларның бөтенлеген һәм аларның нисбәтен, яки mRNA смарының бөтенлеген ачыклау.Гадәттә, 28S һәм 18S полосалары якты, ачык һәм үткен булса (полосаларның читләренә мөрәҗәгать итәләр), һәм 28S яктылыгы 18S төркеменнән ике тапкырга күбрәк булса, без РНК сыйфатын яхшы дип саныйбыз.
Aboveгарыда без гадәттә кулланган ике ысул, ләкин бу ике ысулның берсе дә РНК эремәсендә калдыклы RNase бармы-юкмы икәнен ачык итеп әйтә алмый.Әгәр чишелештә бик аз RNase булса, аны югарыдагы ысул белән табу авыр, ләкин аннан соңгы энзиматик реакцияләрнең күбесе 37 градустан югары һәм озак дәвам итә.Шул рәвешле, РНК эремәсендә бик аз RNase булса, алдагы экспериментларда үз ролен уйнарга бик уңайлы мохит һәм вакыт булачак, һәм эксперимент бу вакытта салкын булыр.Түбәндә без РНК эремәсендә калдыклы RNase барлыгын раслый торган ысул тәкъдим итәбез.
 
3. atылылыкны саклау тесты
Концентрация үрнәге буенча, РНК эремәсеннән ике 1000 нг РНК сызыгыз һәм аны 0,5 мл центрифуга торбасына кушыгыз, һәм pH 7.0 Tris буферы белән тулы күләмгә 10 ул күләменә өстәгез, аннары трубаның капкасын мөһерләгез.Аларның берсен даими температура су мунчасына 70 ° C куегыз һәм 1 сәгать җылы саклагыз.Калган өлеше -20 ° C суыткычта 1 сәг.Вакыт беткәч, электрофорез өчен ике үрнәкне алыгыз.Электрофорез тәмамлангач, икесенең электрофоретик полосаларын чагыштырыгыз.Әгәр дә икесенең полосалары эзлекле булса яки зур аермасы булмаса (әлбәттә, аларның төркемнәре дә 2 нче ысул шартларына туры килә), димәк, РНК эремәсендә калдыклы RNase пычрануы юк, һәм РНК сыйфаты бик яхшы.Киресенчә, 70 ° C инкубацияләнгән үрнәк ачык деградацияне күрсәтсә, бу РНК эремәсендә RNase пычрануы барлыгын күрсәтә.
 
2 РНК алу өчен эксперименталь ысуллар һәм техника
РНКны чыгарганда без еш очрый торган проблемалар: (1) РНК җитештерүчәнлеге түбән;2) РНК тозның җитди пычрануына ия;3) РНК органик эретүче җитди пычрануга ия;4) деградация һәм башка проблемалар
 
1. Гомуми кулланылган гомуми РНК чыгару реагентлары
Гуанидин изотиокянат ысулы һәм Тризол ысулы - хайваннар тукымаларыннан һәм хайван күзәнәкләреннән гомуми РНКны алу өчен иң еш кулланыла торган ысуллар.Бу аеруча кечкенә үрнәкләр һәм тукымалар өчен аеруча яраклы, мәсәлән, куян тиресеннән һәм хайваннарны тоташтыручы тукымалардан тулы РНК алу;өстәвенә, Тризол, гомуми максатлы лизис реагенты буларак, үсемлек тукымаларын, бактерияләрне, гөмбәләрне һәм башка тукымаларны чыгару өчен дә кулланылырга мөмкин.Полисахаридлар һәм полифеноллар булган үсемлек тукымалары өчен, мәсәлән, камеллия олейферасы, чәй яфраклары, рапс һ.б., гомуми РНКны чыгару өчен CTAB ысулы да кулланылырга мөмкин.

Гадәттәге ысул буларак, ике баганалы ысул шулай ук ​​гадәти температура эшләве аркасында бик популяр, RNase өстәргә кирәк түгел, һәм куркынычсызлык - чыгару өчен хлороформ, феноллар һәм башка органик реагентлар юк.(тәкъдим ителгән продуктлар )

1
2

2. Хайван тукымаларыннан гомуми РНКны чыгару
 
.
(2) Кечкенә тукыманы кисәр өчен, үрнәкне кискәндә тукыманың үзәк өлешен кисәргә, яисә башта тукыманың зур өлешен кисәргә, аннары үрнәкне яңа кисү урында кисәргә чиста кайчы һәм кистергеч кулланыгыз.Алынган тукымалар тулысынча киселгән булырга тиеш, киселгән тукыманы EP трубасына RNaseсыз куярга, лизат өстәргә, киселгән тукымалар лизатка тулысынча тәэсир итәргә һәм гомогенизациягә әзерләнергә тиеш.

(3) Нормаль тукымалар өчен гомогенизация өчен гөмбә чөгендерендәге тукымаларны (30-60 мг) сайлагыз.Әгәр тукымаларда күп күләмдә протеин, май, яки бавыр кебек тыгыз җепле тукымалар булса, киселгән тукымалар күләмен тиешенчә арттырыгыз яки киметегез (өстәмә) 10 ~ 20 мг сайлагыз).
(4) Әгәр дә балык мускуллары, карабодай ите, морза һәм башка тукымалар чыгарылса, үрнәк күләме тиешенчә арттырылырга тиеш (100-200 мг тәкъдим ителә).
.
(6) Соңгы чыгарылыштан соң алынган РНК шунда ук боз тартмасына урнаштырылырга тиеш, РНК деградациясен киметү өчен.

3. Хайван күзәнәкләренең РНК чыгару

(1) Асылмалы күзәнәкләр: центрифуга турыдан-туры ташлагыз, стериль ПБС белән 1-2 тапкыр юыгыз, аннары тиешле күләмдә ПБС белән туктатыгыз, аннары лизиз өчен лизат кушыгыз.Сыеклыкны тулысынча ташлаганнан соң, лизатны турыдан-туры явым-төшемле күзәнәкләргә кушмагыз.Бу тышкы катламдагы лизланган күзәнәкләрдән соң чыгарылган гистон пакетының явым-төшемле күзәнәкләрнең тышкы ягына ябышуына китерәчәк, шуның белән пелет эчендәге күзәнәкләрнең лизат белән бәйләнешен чикләячәк., тулы булмаган күзәнәк лизисы һәм РНК уңышын киметү.

)Лизатны чыгару өчен ферментның EP трубасына кушыгыз.

.

4. РНК чыгару

Antсемлек тукымалары фенолик кушылмаларга бай, яки полисахаридларга бай, яки билгесез икенчел метаболитларны үз эченә ала, яки RNase активлыгы зур.Бу матдәләр күзәнәк лизисыннан соң РНК белән тыгыз кушылып, эри торган комплекслар яки коллоид явым-төшемнәрен барлыкка китерәләр, аларны чыгару авыр.Шуңа күрә, үсемлек тукымасын чыгарганда, үсемлекләр өчен комплект сайларга кирәк.Комплекттагы лизат полифенолларны җиңел оксидлаштыру һәм полисахарид кушылмаларын һәм нуклеин кислоталарын аеру проблемаларын эффектив чишә ала.

(Полисахарид полифенол заводы РНК чыгару өчен, тәкъдим ителгән продуктлар:

(1) plantсемлекнең кабыгы, суган, орлык, яфрак һ.б. тулысынча минометкада булырга тиеш.Тегермән процессында сыек азотны үрнәк эретү өчен вакытында тулыландырырга кирәк.Ampleир үрнәге тиз арада лизатка кушылырга һәм РНК деградациясен булдырмаска тиеш.

(2) Дөге һәм бодай яфрагы кебек җепселле үрнәкләр өчен чыгару күләме тиешенчә киметелергә тиеш, югыйсә тукымаларны тарту һәм лизис тулы булмас, нәтиҗәдә алынган РНК аз уңыш китерә.

(3) Анар җимеше, карбыз җимеше, шабдалы җимеше һ.б. кебек су күп булган үсемлек тукымалары өчен үрнәк күләме тиешенчә арттырылырга тиеш (100-200 мг өстәмә).

4.Гадәттәге тукымалар гомогенизаторлары үсемлек тукымаларын гомогенизацияләүдә эффектив булмаска мөмкин, һәм гадәттә киңәш ителми.

5. РНК алу өчен саклык чаралары

(1) Кисем үрнәкләре кат-кат туңудан һәм эрүдән саклану өчен мөмкин кадәр яңа булырга тиеш.

(2) Тукыманы чыгару вакытында тулысынча җир булырга тиеш, һәм тукыманың күләме артык аз булмаска тиеш.

(3) ampleрнәкне тулысынча ябу өчен лизатны кушканнан соң инкубация вакыты җитәрлек бирелергә тиеш.

(4) Тризол ысулын чыгару өчен кулланганда, стратификациядән соң супернатантны үзләштерү принцибы "күбрәк сулыш алудан азрак сулыш алуны өстен күрә", һәм урта катламга чыгармаска тиеш, югыйсә ул җитди геном ДНК пычрануга китерәчәк.

(5) hingуганда, юу сыеклыгы труба стенасы тирәсенә тулысынча үтеп керергә тиеш.

(6) Колонны чыгару ысулы өчен, юылганнан соң багананы аеру белән беррәттән, адсорбция баганасы шулай ук ​​ультра чиста эскәмиягә урнаштырылырга һәм органик эреткечнең коры булуына тулысынча парга әйләнү өчен 5-10 минут шартлатылырга тиеш.

.Традицион Тризол ярылуында һәм изопропанол явым-төшем ысулында соңгы РНК DEPC суында эри, шуңа күрә таркату өчен тиешле вакыт бирелергә тиеш, һәм центрифуга трубасы төбе пипетка очлары белән өзелергә тиеш.

3 Т.hree РНК концентрациясенең сәбәпләре һәм чишелешләре / сыйфатсыз
 
1. Уңыш бик түбән
Чыгарылган үрнәк бик түбән, гомуми күләм җитәрлек түгел, яисә алынган үрнәк артык күп һәм лизис тулы түгел;чыгару өчен тиешле тукымалар яки тиешле күзәнәкләр кулланылырга тиеш, үрнәкне алдан эшкәртү яхшы эшләнергә тиеш, һәм лизис җитәрлек булырга тиеш.
 
2. Геном калдыклары
Тризол ысулы белән чыгарганда, супернатант катламнан соң урта катламга сеңгәндә, геномның җитди пычрануы барлыкка киләчәк;Урта катламга сеңмәс өчен катлам ясаганда өстәмә игътибар бирелергә тиеш.Әгәр багана ысулы чыгару өчен кулланылса, DNase I булган комплектны чыгару өчен сайлап була.Мембранага кушылган нуклеин кислотасы турыдан-туры DNase I белән үзләштерелә, бу ДНК калдыкларын киметә ала.
 
3. РНК деградациясе
Бу чыгарылган үрнәкнең деградациясе, яисә чыгару процессында килеп чыккан деградация булырга мөмкин;мөмкин булганча, яңа үрнәкләр РНК алу өчен кулланылырга тиеш, һәм җыелган үрнәкләр сыек азотта яки -80 ° C суыткычта сакланырга тиеш, һәм кат-кат туңдыру һәм эретүдән сакланырга кирәк.РНК чыгару процессында RNase / DNase бушлай киңәшләр, центрифуга торбалары һәм башка материаллар кулланылырга тиеш.Чыгару процессы мөмкин кадәр тиз булырга тиеш.Алынган РНК боз тартмасына урнаштырылырга һәм -80 вакытында сакланырга тиеш.Әгәр чыгарылган РНКны гель электрофорезы белән ачыкларга кирәк икән, электрофорез чыгарылганнан соң ясалырга тиеш, һәм электрофорез буферы яңа әзерләнгән белән алыштырылырга тиеш.
 
4. Тоз һәм органик эретүче калдыклар
Чыгару реагентларында фенол һәм гуанидин тозлары, юу эремәсендә этанол бар.Чыгару процессында лизат тулысынча үзләштерелмәгән һәм ташланмаган, юу эремәсе тулысынча кипмәгән.Калдык тозлар һәм органик эреткечләр кире транскрипция һәм PCR өчен зарарлы.Төрле дәрәҗәдәге тыю, шуңа күрә тукымалар лизаты чыгару процессында тулысынча чыгарылырга тиеш, һәм трубаның тирә диварларын юу өчен юу җитәрлек булырга тиеш.Моннан тыш, труба бушатыла һәм шартлатыла - кирәкле адым, бу органик матдәләр калдыкларын тагын да киметәчәк.
 
РНК алу турында күбрәк мәгълүмат алу өчен зинһар, безнең сайтка керегез:
Күбрәк мәгълүмат өчен www.foreivd.com.

7

Пост вакыты: 01-2022 декабрь